Isolation, Transfection og kultur af primære humane monocytter
Summary
Præsenteret her er en optimeret protokol til isolering, culturing, transfficerende, og differentiere menneskelige primære monocytter fra HIV-inficerede individer og sunde kontroller.
Abstract
Humant immundefektvirus (HIV) er fortsat et stort sundhedsproblem på trods af indførelsen af kombineret antiretroviral terapi (cART) i midten af 1990 ‘ erne. Mens antiretroviral behandling effektivt sænker systemisk viral belastning og genopretter normale CD4+ T- celletal, er det ikke rekonstruere et helt funktionelt immunsystem. Et dysfunktionelt immunsystem i HIV-inficerede individer gennemgår cART kan være karakteriseret ved immun aktivering, tidlig aldring af immunceller, eller vedvarende inflammation. Disse betingelser, sammen med comorbiditet faktorer forbundet med HIV-infektion, tilføje kompleksitet til sygdommen, som ikke let kan gengives i cellulære og animalske modeller. For at undersøge de molekylære hændelser underliggende immun dysfunktion hos disse patienter, et system til kultur og manipulere menneskelige primære monocytter in vitro præsenteres her. Specifikt, protokollen giver mulighed for kultur og transfektering af primære CD14+ monocytter opnået fra HIV-inficerede personer gennemgår cART samt fra hiv-negative kontroller. Metoden involverer isolation, kultur og transfektering af monocytter og monocyt-afledte makrofager. Mens kommercielt tilgængelige kits og reagenser er ansat, protokollen giver vigtige tips og optimerede betingelser for vellykket overholdelse og transfektering af monocytter med Mirna efterligner og hæmmere samt med sirnas.
Introduction
Human immundefektvirus-1 (HIV-1) infektion forårsager alvorlig immun dysfunktion, hvilket kan føre til opportunistiske infektioner og erhvervet immundefektsyndrom (AIDS). Selv om HIV-inficerede patienter gennemgår cART er karakteriseret ved lav viral belastninger og normale CD4+ T celletal, funktion af immunsystemet kan blive kompromitteret i disse individer, fører til en dysfunktionel immunrespons, der har været forbundet med en øget risiko for at udvikle kræft1. Mekanismerne i immun dysfunktion hos HIV-patienter på vognen er stort set ukendte. Derfor er karakterisering af patient-afledte immunceller og undersøge deres biologi og funktion er en kritisk komponent i den nuværende HIV-forskning.
Monocytter og makrofager er centrale lovgivere af immunrespons og spille grundlæggende roller i hiv-infektion2,3,4,5. Heterogene og plast i naturen, kan makrofager bredt klassificeres i klassisk aktiveret (M1) eller alternativt aktiveret (m2). Denne generelle klassifikation er nødvendig ved opstilling af forsøgsbetingelser, men makro Fages polariserings status kan vendes af en række cytokiner6,7,8,9. Selv om flere undersøgelser har undersøgt virkningerne af hiv-infektion på monocytter og dendritiske celler, molekylære detaljer af monocyte-medierede svar er stort set ukendte6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Blandt de faktorer, der er involveret i immuncelle regulering og funktion, microRNAs (miRNAs), korte ikke-kodning RNAs at post-transkriptivt regulere genekspression, har vist sig at spille en vigtig rolle i forbindelse med større cellulære veje (dvs. vækst, differentiering, udvikling, og apoptose)20. Disse molekyler er blevet beskrevet som vigtige regulatorer af transkriptionsfaktorer, der er afgørende for at diktere den funktionelle polarisering af makrofager21. Den potentielle rolle Mirnas i monocytter fra HIV-inficerede personer gennemgår cART er blevet undersøgt, men fremskridt på området kræver meget mere arbejde22,23,24,25,26. Dette papir diskuterer en optimeret metode til transficere Mirnas og sirnas til primære humane monocytter fra HIV-inficerede patienter og kontrol.
Denne protokol er baseret på kommercielt tilgængelige reagenser og kits, da kontinuitet i den tekniske procedure hjælper med at eliminere unødvendige eksperimentelle variabler, når der arbejdes med kliniske prøver. Ikke desto mindre, metoden giver vigtige tips (dvs. antallet af celler belagt eller kort inkubation med serum-fri medier til at fremme tilslutningen af celler til pladen). Desuden er de polariserings betingelser, der anvendes i denne protokol, afledt af offentliggjort arbejde27,28,29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede protokol viser brugen af primære celler fra HIV-inficerede forsøgspersoner som en model til at studere monocytter og makrofager. HIV+ patienter gennemgår cART lever med infektion i flere år og kan også have andre co-infektioner relateret et kompromitteret immunsystem. For at studere immunmodulerende i nærværelse af HIV kronisk infektion, celler blev høstet fra patienter direkte. Da miRNAs har vist sig at spille en større rolle i celle udvikling og differentiering, fokuserer protokoll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke hiv-kliniske/tumor biorepositive kerne for at give patientprøver og cellulær immunologi metabolisme kerne for at give flow flowcytometri analyse. Dette projekt blev finansieret af NIH P20GM121288 og P30GM114732.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
