Summary
Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.
Abstract
Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) blijft een belangrijke gezondheidszorg ondanks de introductie van gecombineerde antiretrovirale therapie (cART) in het midden van de jaren 1990. Hoewel antiretrovirale therapie de systemische virale belasting efficiënt verlaagt en het normale aantal CD4+ T-cellen herstelt, vormt het geen volledig functioneel immuunsysteem. Een disfunctioneel immuunsysteem in HIV-geïnfecteerde personen die kar ondergaan kan worden gekenmerkt door immuun activering, vroege veroudering van immune cellen, of aanhoudende ontsteking. Deze voorwaarden, samen met comorbide factoren die gepaard gaan met HIV-infectie, voegen complexiteit toe aan de ziekte, die niet gemakkelijk kan worden gereproduceerd in cellulaire en dierlijke modellen. Om te onderzoeken van de moleculaire gebeurtenissen onderliggende immuundisfunctie bij deze patiënten, een systeem voor cultuur en manipuleren van menselijke primaire monocyten in vitro wordt hier gepresenteerd. Specifiek, het protocol maakt het mogelijk voor de cultuur en transfectie van primaire CD14+ monocyten verkregen van HIV-geïnfecteerde personen die kar en HIV-negatieve controles ondergaan. De methode omvat isolatie, cultuur en transfectie van monocyten en monoyte-afgeleide macrofagen. Terwijl in de handel verkrijgbare kits en reagentia worden gebruikt, biedt het protocol belangrijke tips en geoptimaliseerde voorwaarden voor een geslaagde hechting en transfectie van monocyten met Mirna bootst en remmers, evenals met sirna's.
Introduction
Humaan immunodeficiëntie virus-1 (HIV-1) infectie veroorzaakt ernstige immuundisfunctie, wat kan leiden tot opportunistische infecties en verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS). Hoewel HIV-geïnfecteerde patiënten die cART ondergaan worden gekenmerkt door lage virale belastingen en normale CD4+ T-celtellingen, kan de werking van het immuunsysteem in deze individuen worden aangetast, wat leidt tot een disfunctionele immuunrespons die is gekoppeld aan een verhoogd risico op het ontwikkelen van kanker1. De mechanismen van immuun disfunctie bij HIV-patiënten in de winkelwagen blijven grotendeels onbekend. Daarom is het karakteriseren van patiënt afkomstige immuuncellen en het onderzoeken van hun biologie en functie een essentieel onderdeel van het huidige HIV-onderzoek.
Monocyten en macrofagen zijn belangrijke regulatoren van immuunresponsen en spelen fundamentele rollen bij HIV-infectie2,3,4,5. Heterogene en kunststof in de natuur, macrofagen kunnen breed worden geclassificeerd in klassiek geactiveerde (M1) of als alternatief geactiveerd (m2). Hoewel deze algemene indeling nodig is bij het instellen van experimentele omstandigheden, kan de polarisatie status van macrofagen worden omgekeerd door een verscheidenheid van cytokines6,7,8,9. Hoewel verschillende studies de effecten van HIV-infectie op monocyten en dendritische cellen hebben onderzocht, zijn de moleculaire Details van monocyte-gemedieerde reacties grotendeels onbekend6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Onder de factoren die betrokken zijn bij de regulering en functie van immuun cellen, microRNAs (miRNAs), korte niet-Codeer Rna's die na transcriptioneel de genexpressie reguleren, is aangetoond dat het een belangrijke rol speelt in de context van belangrijke cellulaire trajecten (d.w.z. groei, differentiatie, ontwikkeling en apoptosis)20. Deze moleculen zijn beschreven als belangrijke regulatoren van transcriptiefactoren die essentieel zijn voor het diceren van de functionele polarisatie van macrofagen21. De mogelijke rol van miRNAs in monocyten van HIV-geïnfecteerde personen die kar ondergaan is onderzocht, maar vooruitgang in het veld vereist veel meer werk22,23,24,25,26. Deze paper bespreekt een geoptimaliseerde methode om miRNAs en siRNAs te transfect in primaire humane monocyten van HIV-geïnfecteerde patiënten en controles.
Dit protocol is gebaseerd op in de handel verkrijgbare reagentia en kits, omdat de continuïteit in de technische procedure helpt bij het elimineren van onnodige experimentele variabelen bij het werken met klinische monsters. Niettemin, de methode biedt belangrijke tips (dat wil zeggen, het aantal cellen verguld of korte incubatie met serum vrije media om de hechting van cellen aan de plaat te bevorderen). Bovendien zijn de in dit Protocol gebruikte polarisatie omstandigheden afgeleid van het gepubliceerde werk27,28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hieronder beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans institutioneel Review Board. Al het bloed werd verzameld na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming.
Opmerking: de gehele procedure wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een faciliteit voor bioveiligheid niveau 2 (BSL2), zodat voorzichtigheid wordt gebruikt voor het omgaan met biologische materialen. In het bijzonder wordt elke stap uitgevoerd met behulp van steriele technieken onder een bioveiligheidskast. Na elke stap waarbij bloed, bloedproducten, cellen of pipetteren van het product zijn betrokken, is het belangrijk om al het plastic materiaal (d.w.z. Serologische pipetten, pipetpunten en buizen) te spoelen met 10% bleekwater uit een afvalbak in de afzuigkap voorafgaand aan de juiste afvoer.
1. isolatie van primaire humane monocyten door immunomagnetische negatieve selectie
- Verzamel 40 mL vers, menselijk volbloed (van ofwel een HIV+ patiënt of een gezonde controle) in 4 10 ml ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) vacuümbuizen (10 ml bloed per buis). Gebruik steriele technieken onder een bioveiligheidskast en breng alle 40 mL bloed over in 1 50 mL conische propyleen buis.
- Volg het Protocol van de fabrikant voor de geselecteerde Human monocyt Isolation Kit (tabel met materialen), voeg 2 ml monocyt Isolation cocktail toe, in de kit, aan de buis van het bloed. Vortex magnetische kralen, ook voorzien in de kit, voor 30 s, en voeg 2 mL aan de buis van bloed.
- Als er minder dan 40 mL bloed beschikbaar is, schaaf dan de toegevoegde reagentia. Om de oplossing te mengen, Pipetteer op en neer met een plastic 25 mL serologische pipet en inincuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Scheid het bloed mengsel gelijkmatig in 4 50 mL buizen en Voeg 30 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1 mM EDTA toe aan elke buis. Meng door Pipetteer op en neer met een plastic 25 mL serologische pipet.
- Plaats de buisjes in magneet houders gedurende 10 minuten om de antilichaam-geconjugeerde magnetische kralen te verwijderen. Gebruik vier magneet houders tegelijk, één voor elke buis, om consistente incubatie-en isolatie tijden toe te staan voor elk bloedmonster.
- Trek de inhoud uit het midden van elke buis met behulp van een pipet, terwijl ze zich nog in de magneet houders bevinden. Zorg ervoor dat u geen rode bloedcellen optekent (niet meer dan 10% van het 10 mL start volume) en plaats de inhoud in een van de vier nieuwe buizen van 50 mL.
- Voeg 500 μL gevortext magnetische kralen toe aan elke buis van 50 ml. Pipetteer op en neer met een pipet van 25 mL en inincuberen op RT gedurende 5 minuten. Plaats de buisjes vervolgens in magneet houders gedurende 5 min.
- Breng de inhoud voorzichtig vanuit het midden van elke buis over terwijl u nog steeds in magneet houders in een van de vier nieuwe buizen van 50 mL zit. Plaats elke nieuwe tube van 50 mL direct in de magneet houders gedurende 5 min.
- Breng de inhoud van het midden van elke buis voorzichtig over in een van de vier nieuwe buizen van 50 mL. Spin alle nieuwe 50 mL tubes bij 300 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant en Redigeer alle vier celpellets in een totaal van 10 ml steriele PBS.
- Tel cellen door trypan blauwe uitsluiting met behulp van een hemocytometer.
Opmerking: 8-20 x 106 cellen worden over het algemeen verkregen uit 40 ml volbloed.
2. culturing van primaire humane monocyten
- Met behulp van een 37 ° c waterbad, warme serum vrije rpmi 1640 media aangevuld met 1% penicillaire-streptomycine (pen/STREP), en (terwijl u steriele technieken onder een bioveiligheid Cabinet blijft gebruiken) hervat de geïsoleerde monocyten in deze media met een concentratie van 1 x 106 cellen/ml.
- Voeg 1 mL geresuspendeerde cellen toe aan elk goed van een 6-goed plaat of in een 35 mm-schotel (het laatste aantal cellen moet 1 x 106 -cellen/plaat zijn) en plaats in een incubator van 37 °c met 5% Co2. Wacht 0,5-1,0 h voor cellen om te hechten.
- Met behulp van een 37 °C waterbad, warm warmtegeïnactiveerd (HI) foetaal runderserum (FBS). Voeg aan elke plaat 100 μL (10% eindconcentratie) van de FBS toe. Voeg groeifactoren toe aan de cellen om macrofaag differentiatie te bevorderen.
- Prime macrofagen voor een M1-achtig fenotype door toevoeging van 25 ng/mL granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) aan de media. Prime macrofagen voor een m2-achtig fenotype door toevoeging van 50 ng/mL macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF) aan media28.
Opmerking: zowel GM-CSF als M-CSF maken het mogelijk om monoyte-differentiatie toe te staan aan een algemeen macrofaag-fenotype (M0) terwijl het priming van cellen voor M1 of m2, respectievelijk7,28,30.
- Prime macrofagen voor een M1-achtig fenotype door toevoeging van 25 ng/mL granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) aan de media. Prime macrofagen voor een m2-achtig fenotype door toevoeging van 50 ng/mL macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF) aan media28.
3. transfecting primaire humane monocyten in cultuur
- Monocyten met Mirna bootst of remmers of siRNA met behulp van een kit die een polymeer-gebaseerd transfectie-reagens bevat (tabel met materialen).
- Na het Protocol van de fabrikant voor de transfectie Kit (en voortzetting van het gebruik van steriele technieken onder een bioveiligheid Cabinet), Verdun eerst de geselecteerde Mirna Mimics/remmers of sirna's in de buffer tot een eindconcentratie van 1,83 μM. bereid 10 μL verdund nabootsen/inhibitor per transfectie van 1 x 106 cellen.
- Bereid het transfectie reagens door 1 μL van het meegeleverde polymeer toe te voegen aan een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL, onmiddellijk gevolgd door toevoeging van 90 μL meegeleverde buffer (voor een totaal van 91 μL reagens per trans fectie). Vortex voor 3-5 s.
- Pipetteer 90 μL van de transfectie oplossing in de buis met 10 μL verdunde miRNA-nabootsen/remmers of siRNA. Meng door voorzichtig pipetteren en inbroed gedurende 15 minuten bij RT.
- Voeg 100 μL transfectie complex toe aan één put (of schotel) van 1 x 106 geplateerde monocyten. Inbroed cellen gedurende 4 uur bij 37 °C en vervang vervolgens het medium door 3 mL complete media (RPMI 1640 aangevuld met 1% penicillaire-streptomycine en 10% warmte-geïnactiveerd FBS) die ofwel GM-CSF of M-CSF bevatten.
4. M1/M2 differentiatie en activering
- Monocyten beginnen onmiddellijk te differentiëren naar brede M0 macrofagen bij het beplating in de cultuur. Op de derde dag na het beplating, doorgaan met het gebruik van steriele technieken onder een bioveiligheid Cabinet en vervangen van media met 3 ml verse rmpi 1640 media (aangevuld met 1% penicillaire-streptomycine, 10% warmte-geïnactiveerd FBS, en 25 ng/ml GM-CSF ter bevordering van M1-achtige polarisatie of 50 ng/ml M-CSF ter bevordering van m2-achtige Kweek de cellen in deze omstandigheden voor een totaal van 6 dagen vanaf de initiële beplating in een incubator bij 37 °C, 5% CO2.
- Voor de polarisatie van de GEPRIMEERDE cellen naar het M1-macrofaag fenotype, Activeer cellen op dag 6 van incubatie door het vervangen van celmedia met nieuwe media die 5% warmte-geïnactiveerd FBS, 1% pen/STREP, 100 ng/mL E. coli-afgeleide lipopolysaccharide (LPS), en 20 ng/ml interferon-gamma (IFN-γ).
- Om polarisatie van GEPRIMEERDE cellen naar het m2-macrofaag fenotype te voorkomen, activeert u cellen op dag 6 van incubatie door celmedia te vervangen door nieuwe media met 5% warmte-geïnactiveerde FBS, 1% pen/STREP, 10 ng/mL M-CSF en 20 ng/mL Interleukine 4 (IL-4).
- Oogst na 24 uur de cellen voor RNA-, proteïne-of Flowcytometrie-analyses.
- Wanneer cellen klaar zijn om te worden afgekoeld, wast u cellen in de schaal 2x met PBS (bij RT voor RNA-extractie of gekoeld op ijs voor EiwitExtractie). Omdat de gedifferentieerde macrofagen nu stevig aan de platen zijn bevestigd, lyseer de cellen in platen rechtstreeks om materiaal te verkrijgen voor RNA-en eiwit analyses.
- Voor het verzamelen van materiaal voor Flowcytometrie, voeg PBS met 2 mM EDTA toe aan het schaaltje, inbroed de cellen gedurende 10 minuten bij 37 °C, schuif de cellen voorzichtig uit de schaal en verzamel de inhoud in een micro centrifugebuis van 1,5 mL voordat u verdergaat met standaardprotocollen.
5. stroom cytometrie
- Spoel cellen in PBS uit om het kweekmedium te verwijderen. Draai 100.000 cellen uit (per elke stroom cytometrie voorwaarde) en regeer de pellet in 100 μL PBS met 2 μL HuFcR bindings remmer. Incuberen bij RT gedurende 15 minuten.
- Voeg 50 μL kleurings buffer en de gewenste antilichamen (hier, CD80, CD83, CD163 en CD209 gebruikt) toe in de aanbevolen hoeveelheden.
- Meng zachtjes en inincuberen bij 4 °C in het donker gedurende 30 minuten.
- Was 2x met PBS en hervat de bevlekte cellen in 150 μL PBS voordat u het monster op een cytofluorimeter uitvoert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de beschreven procedure werden primaire humane monocyten van HIV-geïnfecteerde personen en gezonde donoren geïsoleerd. Alle hier gepresenteerde gegevens werden verkregen van HIV+ -proefpersonen die een kar ondergingen met een lage (< 20 kopieën/ml) of niet-detecteerbare virale ladingen en normale CD4+ T-cellen. Onmiddellijk na isolatie, cellen werden gekleurd, en flow cytometrie werd uitgevoerd om te bevestigen van de zuiverheid van de celpopulaties. Resultaten toonden aan dat > 97% van de cellen gekleurd positief voor CD14 (gegevens niet weergegeven). Voor polarisatie van macrofagen werd een gepubliceerd protocol gebruikt28. Primaire menselijke monocyten werden gekweekt in de aanwezigheid van GM-CSF of M-CSF voor 6 dagen. Op de zesde dag werden cellen geactiveerd in de richting van een macrofagen van M1 of m2. Vierentwintig uur na activering, cellen werden geoogst en gekleurd voor Flowcytometrie analyse van macrofaag celmarkeringen.
Figuur 1 toont representatieve histogrammen van M1-geactiveerde controle-(Figuur 1A) en patiënt-afgeleide (Figuur 1B) cellen met verhoogde niveaus van CD80 en CD83 en verlaagde niveaus van CD163 in vergelijking met niet-geactiveerde T0 cellen, evenals m2-geactiveerde cellen met verhoogde niveaus van CD163 en CD209. Panel C in toont uitdrukking van CD80, CD83, CD163, en CD209 in M1 en m2 gepolariseerde cellen. De grafiek vertegenwoordigt de gemiddelde gegevens verkregen uit drie besturings-en drie HIV-afgeleide sets van cellen. Zoals verwacht stegen de uitdrukkings niveaus van CD80 en CD83 in M1 in vergelijking met m2 gepolariseerde cellen, terwijl CD209 en CD163 meer sterk werden uitgedrukt in m2 in vergelijking met M1 gepolariseerde cellen. Interessant, CD80 en CD83 leken meer sterk uitgedrukt in Control-afgeleide cellen in vergelijking met HIV-afgeleide cellen. Mogelijke verschillen in de mogelijkheid tot polarisatie en/of uitdrukkings niveaus van polariseer tekens in HIV-afgeleide cellen in vergelijking met besturingselementen vereisen echter verder onderzoek. Hoewel GM-CSF, M-CSF, LPS en IFN-γ werden gekozen als behandelingen, kunnen andere combinaties van groeifactoren, cytokines of stimulatoren worden gebruikt met dit protocol28.
Na voorbereidende experimenten bleek dat de isolatie procedure succesvol was, werden vers verzamelde monocyten verguld in 6 goed platen en getransffecteerd met een roerei, dichtbij-infrarood-gelabelde miRNA om de transfectie-efficiëntie te bepalen. Cellen werden gefotografeerd 24 h post-transfectie door fluorescerende confocale microscopie. Met deze methode werd > 90% efficiëntie van transfectie bereikt, zoals bepaald door Flowcytometrie (Figuur 2A) en confocale microscopie (Figuur 2B).
Vervolgens werd de levensvatbaarheid van de cellen na de trans fectie bepaald. Figuur 3 toont de levensvatbaarheid van cellen, bepaald met behulp van een colorimetrische assay als een gemiddelde van cellen die zijn afgeleid van twee patiënten (Figuur 3a) en twee besturingselementen (Figuur 3b), die op dag 1 (Figuur 3a) of dag 4 (Figuur 3b) zijn gekapt en op dag 7 zijn geoogst. Voor dit experiment werden 50.000 cellen verguld op een 96 multi-well plaat en na het protocol getransffecteerd. In het algemeen heeft transfectie de levensvatbaarheid van cellen niet significant verminderd, ongeacht het stadium van rijping van de cellen en de transfectie condities (d.w.z. bespotten, Roerei siRNA/miRNA of siRNA/miRNA). Opgemerkt moet worden dat Figuur 3 gegevens vertegenwoordigt die zijn verkregen uit cellen die zijn afgeleid van patiënten (panel A) en besturings cellen (panel B). Dit was noodzakelijk, omdat er niet genoeg cellen waren om het volledige experiment uit te voeren (zowel de levensvatbaarheid als de Western Blot voor dag 1-en dag 4-trans fecties, in zes verschillende omstandigheden per transfectie) met één enkel monster konden worden verkregen. Niettemin biedt het cijfer representatieve resultaten die kunnen worden verkregen met cellen die zijn gebaseerd op controle of patiënten.
Vervolgens werd de werkzaamheid van siRNA transfectie op doel-mRNA beoordeeld door de evaluatie van de eiwit expressie. Resultaten in Figuur 4 tonen effectieve Downregulatie van EIF4EBP1, een translationele regulator die zeer overvloedig aanwezig is in deze cellen, op transfectie met een specifieke siRNA op beide dag 1 (Figuur 4a) en dag 4 (Figuur 4C). Dezelfde regulator handhaafde ook uitdrukking onder de verschillende controle omstandigheden (d.w.z. niet-getransfunde, bespotten, roerloos siRNA en EIF4EBP1 siRNA zonder transfectie reagens: siR *). Kwantificering van westerse Blot-experimenten voor dag 1-en dag 4-trans fectie worden respectievelijk weergegeven in Figuur 4B en Figuur 4D. Bovendien werden uitdrukkings niveaus van miR-146A-5p na transfectie op dag 1 of dag 4 door RT-qPCR van HIV-afgeleide cellen vastgesteld (Figuur 4E). Cellen die met miRNA nabootsen, vertoonden een 48-tot 72-voudige toename van de miRNA-uitdrukking over niet-getranssinfecteerde cellen, terwijl alle transfectie-controles geen noemenswaardige veranderingen vertonen.
Figuur 1: monocyte-afgeleide macrofagen zijn met succes gepolariseerd en geactiveerd naar M1 of m2 macrofaag fenotypes. Flowcytometrie analyseresultaten van cellen die zijn afgeleid van één gezonde controle (a) en één HIV-afgeleid Celmonster (B) tonen niveaus van CD80, CD83, CD163 en CD209. Het experiment werd herhaald met twee extra controles en twee extra HIV-positieve monsters met vergelijkbare resultaten. Celpopulatie van belang werd afgesloten op basis van voorwaartse en zijspreidings parameters, gevolgd door discriminatie van Doublet. C) staafdiagram met CD80, CD83, CD163 en CD209 in de gepolariseerde cellen M1 en m2. De grafiek vertegenwoordigt de gemiddelde gegevens en standaarddeviaties die zijn verkregen van drie besturings-(CTRL) en drie HIV-afgeleide (PTS) sets van cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: primaire menselijke CD14+ cellen worden efficiënt met miRNAs getransffecteerd. A) analyse van de stroom cytometrie van primaire monocyten, afgeleid van gezonde controles, 24 h post-transfectie, met > 90% transfectie-efficiëntie. B) representatief confocale beeld genomen 24 h na-transfectie toont aan dat alle cellen in het veld de Mirna hebben geconjugeerd met een Near-Infrared kleurstof (in wit). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: levensvatbaarheid van getransfunteerde cellen. Grafiek balken vertegenwoordigen de gemiddelde levensvatbaarheid van de cellen van twee patiënten met HIV+ (a) en twee gezonde controles (b) , bepaald aan de hand van een colorimetrische Assay, na transfectie met miR-146A-5P of siRNA tot EIF4EBP1 (siRNA) en de passende controles op dag 1 (a) of dag 4 (b), allemaal getest op dag Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: efficiënte Downregulatie van eiwit niveaus op siRNA/Mirna transfectie na isolatie van CD14+ monocyten. Controle-en HIV-afgeleide monocyten (1 x 106 cellen) werden op dag 1 (a) of dag 4 (C) na isolatie met siRNA tegen EIF4EBP1 mRNA getransffecteerd. De panelen (B) en (D) vertegenwoordigen de kwantificering van EIF4EBP1 uitdrukking ten opzichte van gapdh en worden uitgedrukt als het percentage boven de mock voor de patiënt (PT) of de controle (CTRL) (A) of niet-getransffecteerd voor patiënt of controle (B). E) representatieve staafgrafiek van twee experimenten met miR-146A-5p-expressie in met HIV afgeleide cellen die op dag 4 (staven 1-4) of dag 1 (rechter balk) zijn gefuteerd en op dag 7 zijn geoogst. De vouw verandering wordt berekend over het niet-getransfuneerde monster (siR = siRNA). siR * of miR-145a-5p * duiden op incubatie van de cellen met siRNA of miR-146A-5p zonder het transfectiereagens. Het experiment werd herhaald 2x met Control-afgeleide cellen en geproduceerd in wezen dezelfde resultaten (gegevens niet weergegeven). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepresenteerde protocol toont het gebruik van primaire cellen van HIV-geïnfecteerde onderwerpen als een model voor het bestuderen van monocyten en macrofagen. HIV+ patiënten ondergaan kar leven met infectie voor meerdere jaren en kunnen ook andere co-infecties gerelateerd een gecompromitteerd immuunsysteem. Om immunomodulatie te bestuderen in de aanwezigheid van een chronische HIV-infectie, werden cellen rechtstreeks van patiënten geoogst. Aangezien miRNAs belangrijke rollen speelt in celontwikkeling en differentiatie, richt het Protocol zich op de mogelijkheid om de miRNA-uitdrukking in deze primaire cellen te manipuleren (Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4). Met dezelfde procedure werkt dit protocol ook heel goed voor Sirna's (Figuur 3, Figuur 4). Als gevolg van de mogelijke fagocytische activiteit van volwassen macrofagen, naast mock en Scramble siRNA Controls, wordt een controle gebruikt (aangeduid als Sir * of miR * in Figuur 3 en Figuur 4), waarin het transfectie reagens wordt weggelaten. Gegevens bevestigen dat het transfectie-reagens nodig is voor een goede siRNA/Mirna-levering in de cellen, omdat zonder het reagens cellen de Mirna of siRNA niet spontaan in de opname brengen, zelfs als ze al zijn gedifferentieerd in macrofagen (dag 4 na plating en polarisatie, Figuur 3 en Figuur 4).
Tijdens het gebruik van commercieel verkrijgbare Kits voor isolatie en transfectie van Human Primary CD14+ monocyten, zijn er belangrijke stappen geoptimaliseerd om de procedure reproduceerbaar en succesvol te maken. Specifiek, 1) het aantal cellen verguld is essentieel voor hun overleving en differentiatie, en 1 x 106 cellen/35 mm schotel bleek te werken het beste. 2) vers geïsoleerde CD14+ cellen hechten niet uniform aan de kweek schaal als ze in aanwezigheid van FBS worden geseelleerd. Als gevolg daarvan, bij het vervangen van het medium 4 h na transfectie, alle niet-bevestigde cellen zullen worden verwijderd, waardoor plaat-naar-plaat condities zeer variabel. 3) er werd geconstateerd dat het vervangen van het medium 4 h na de trans fectie, vermindert de toxiciteit als gevolg van trans fectie reagentia zonder afbreuk te doen aan de efficiëntie van transfection. 4) transfectie condities werden geoptimaliseerd om minder siRNA of miRNA (15 nM) te vereisen dan concentraties aanbevolen door de fabrikant (25 nM). 5) als gevolg van de zeer hecht karakter van de cellen, het toevoegen van lysis buffer direct aan de plaat verbetert sterk de concentratie van eiwitten of RNA geoogst. Als het echter nodig is om cellen van de plaat te verwijderen (d.w.z. voor Flowcytometrie-analyse), is het het beste om PBS te gebruiken met EDTA en de cellen zachtjes te schrazen. Deze methode vermindert het aantal verzamelde cellen met ongeveer 20%-30%, dus het is belangrijk om experimenten dienovereenkomstig te plannen om voldoende celaantallen te verkrijgen voor verdere analyse.
Wanneer correct gevolgd, deze procedure demonstreert het verkrijgen van zeer zuivere CD14+ populatie van monocyten, transfectie van sirna's en kleine Rna's zoals miRNAs, cultuur voorwaarden, en differentiatie in M1 of m2 macrofagen. Deze methode kan worden toegepast om complexe ziekten of infecties anders dan HIV te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de HIV klinische/tumor Biorepository kern bedanken voor het verstrekken van patiënt monsters en de cellulaire immunologie metabolisme kern voor het verstrekken van Flowcytometrie analyse. Dit project werd gefinancierd door NIH P20GM121288 en P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
