Isolasjon, Transfeksjoner, og kultur for Primary Human monocytter
Summary
Presentert her er en optimalisert protokoll for å isolere, dyrking, transfecting, og differensiere menneskets primære monocytter fra HIV-smittede individer og sunne kontroller.
Abstract
Humant immunsviktvirus (HIV) er fortsatt en stor helse bekymring til tross for innføringen av kombinert antiretroviral behandling (cART) på midten av 1990-tallet. Mens antiretroviral behandling effektivt senker systemisk viral belastning og gjenoppretter normal CD4+ T celle tellinger, betyr det ikke Rekonstituer en helt funksjonell immunsystem. En dysfunksjonelle immunsystem i HIV-infiserte individer under cART kan være preget av immun aktivering, tidlig aldring av immunceller, eller vedvarende betennelse. Disse forholdene, sammen med komorbide faktorer forbundet med HIV-smitte, legger kompleksiteten til sykdommen, som ikke kan lett gjengis i cellulære og dyremodeller. For å undersøke den molekylære hendelser underliggende immun dysfunksjon hos disse pasientene, et system til kultur og manipulere menneskelig primære monocytter in vitro er presentert her. Nærmere bestemt, tillater protokollen for kultur og transfeksjoner av primære CD14+ monocytter innhentet fra HIV-infiserte individer gjennomgår cART så vel som fra HIV-negative kontroller. Metoden innebærer isolasjon, kultur, og transfeksjoner av monocytter og monocytt-avledede makrofager. Mens kommersielt tilgjengelige kits og reagenser er ansatt, gir protokollen viktige tips og optimaliserte vilkår for vellykket overholdelse og transfeksjoner av monocytter med miRNA og hemmere, så vel som med siRNAs.
Introduction
Humant immunsviktvirus-1 (HIV-1) infeksjon forårsaker alvorlig immun dysfunksjon, som kan føre til opportunistiske infeksjoner og ervervet immunsviktsyndrom (AIDS). Selv om HIV-smittede pasienter under cART er preget av lav viral belastninger og normal CD4+ T Cell teller, funksjon av immunsystemet kan bli kompromittert i disse individene, som fører til en dysfunksjonelle immunrespons som har vært knyttet til en økt risiko for å utvikle kreft1. Mekanismene for immun dysfunksjon i HIV-pasienter i handlevognen fortsatt i stor grad ukjent. Derfor karakteriserer pasient-avledet immunceller og gransker deres biologi og funksjon er en kritisk komponent i dagens HIV-forskning.
Monocytter og makrofager er sentrale regulatorer av immunresponser og spille grunnleggende roller i HIV-smitte2,3,4,5. Heterogen og plast i naturen, makrofager kan grovt klassifiseres i klassisk aktivert (M1) eller alternativt aktivert (M2). Mens denne generelle klassifiseringen er nødvendig når du setter opp eksperimentelle vilkår, polarisering status av makrofager kan reverseres av en rekke cytokiner6,7,8,9. Selv om flere studier har undersøkt virkningene av HIV-smitte på monocytter og dendrittiske celler, molekylære detaljer om monocytt-mediert svar er i stor grad ukjent6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Blant de faktorene som er involvert i immun celle regulering og funksjon, microRNAs (miRNAs), kort ikke-koding RNAs at post-transcriptionally regulere genuttrykk, har vist seg å spille en viktig rolle i sammenheng med store cellulære veier (dvs. vekst, differensiering, utvikling, og apoptose)20. Disse molekylene har blitt beskrevet som viktige regulatorer av transkripsjon faktorer avgjørende for å diktere funksjonell polarisering av makrofager21. Den potensielle rollen til miRNAs i monocytter fra HIV-infiserte individer gjennomgår handlevognen har blitt undersøkt, men fremgangen i feltet krever mye mer arbeid22,23,24,25,26. Dette papiret diskuterer en optimalisert metode for å transfect miRNAs og siRNAs i primære menneskelige monocytter fra HIV-infiserte pasienter og kontroller.
Denne protokollen er avhengig av kommersielt tilgjengelige reagenser og sett, som kontinuitet i den tekniske prosedyren bidrar til å eliminere unødvendige eksperimentelle variabler når du arbeider med kliniske prøver. Likevel gir metoden viktige tips (dvs. antall celler belagt eller kort inkubasjons med serum-frie medier for å fremme overholdelse av celler til platen). I tillegg er polarisering forholdene som brukes i denne protokollen avledet fra publisert arbeid27,28,29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte protokollen demonstrerer bruk av primær celler fra HIV-smittede som en modell for å studere monocytter og makrofager. HIV+ pasienter gjennomgår cART leve med infeksjon i flere år og kan også ha andre co-infeksjoner knyttet en kompromittert immunsystem. Å studere immunomodulation i nærvær av HIV kronisk infeksjon, celler ble høstet fra pasienter direkte. Som miRNAs har vist å spille store roller i celle utvikling og differensiering, fokuserer protokollen på evnen til å manipulere miR…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke HIV Clinical/tumor Biorepository Core for å gi pasienten prøver og Cellular immunologi metabolisme Core for å gi flyt flowcytometri analyse. Dette prosjektet ble finansiert av NIH P20GM121288 og P30GM114732.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
