Wederzijdse hemizygosity via sequencing (RH-SEQ) is een krachtige nieuwe methode om de genetische basis van een eigenschap verschil tussen soorten in kaart te worden. Pools van hemizygotes worden gegenereerd door transposon mutagenese en hun fitheid wordt bijgehouden door concurrerende groei met behulp van High-through sequencing. Analyse van de resulterende gegevens wijst genen aan die aan de eigenschap ten grondslag liggen.
Een centraal doel van de moderne genetica is om te begrijpen hoe en waarom organismen in het wild verschillen in fenotype. Tot op heden is het veld grotendeels uitgebreid op de sterkte van koppelings-en koppelingsmethoden, die de relatie tussen DNA-sequentie varianten en fenotype over recombinant nageslacht van paringen tussen individuen van een soort traceren. Deze benaderingen, hoewel krachtig, zijn niet goed geschikt voor eigenschap verschillen tussen reproductief geïsoleerde soorten. Hier beschrijven we een nieuwe methode voor genoom-brede dissectie van natuurlijke eigenschap variatie die gemakkelijk kan worden toegepast op onverenigbare soorten. Onze strategie, RH-seq, is een Genome-brede implementatie van de wederzijdse hemizygote-test. We hebben het aangewend om de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de opvallende hoge temperatuur groei van de gist Saccharomyces cerevisiae ten opzichte van zijn zuster soorten S. paradoxus. RH-SEQ maakt gebruik van transposon-mutagenese om een pool van wederzijdse hemizygoten te creëren, die vervolgens worden gevolgd door een hoge-temperatuur competitie via een hoge doorvoer volgorde. Onze RH-SEQ workflow zoals hier uiteengezet biedt een rigoureuze, onbevooroordeelde manier om oude, complexe eigenschappen in de ontluikende gist clade te ontleden, met het voorbehoud dat resource-intensieve Deep sequencing nodig is om genomische dekking voor genetische mapping te garanderen. Als sequencing kosten dalen, deze aanpak houdt grote belofte voor toekomstig gebruik over eukaryoten.
Sinds het begin van het veld, het is een belangrijker doel in de genetica om te begrijpen van de mechanistische basis van variatie tussen wilde individuen. Als we loci in kaart plaatsen die aan een kenmerk van belang zijn gekoppeld, kunnen de opkomende genen onmiddellijk worden gebruikt als doelstellingen voor diagnostiek en drugs, en kunnen ze licht werpen op de principes van evolutie. De industriestandaard in de richting van dit doel is om te testen op een relatie tussen genotype en fenotype over een populatie via koppeling of vereniging1. Krachtig als deze benaderingen zijn, ze hebben een belangrijke beperking-ze vertrouwen op grote panelen van recombinant nageslacht van kruisen tussen interfertile individuen. Ze zijn niet van toepassing in de studie van soorten die niet kunnen paren om in de eerste plaats nakomelingen te vormen. Als zodanig heeft het veld weinig capaciteit voor onbevooroordeelde dissectie van eigenschap-verschillen tussen reproductief geïsoleerde soorten2.
In dit werk rapporteren we de technische onderbouwing van een nieuwe methode, RH-SEQ3, voor genoom onderzoeken van de genetische basis van eigenschap variatie tussen soorten. Deze aanpak is een massaal parallelle versie van de wederzijdse hemizygote test4,5, die eerst werd bedacht als een manier om de fenotypische effecten van allel verschillen tussen twee genetisch verschillende achtergronden te evalueren op een bepaalde Locus (Figuur 1a). In deze regeling worden de twee divergente personen voor het eerst tot een hybride, waarvan de helft afkomstig is van elk van de respectieve ouders. In deze achtergrond worden meerdere stammen gegenereerd, elk met een onderbroken of verwijderde kopie van het allel van elke ouder van de Locus. Deze stammen zijn hemizygoot, omdat ze overal in het genoom diploïde blijven, behalve op de Locus van belang, waar ze worden beschouwd als haploïde, en worden aangeduid als wederkerig omdat ze slechts één ouder allel missen, met zijn overgebleven allel afgeleid van de andere ouder. Door de fenotypes van deze wederzijdse hemizygote stammen te vergelijken, kan men concluderen of DNA sequentie varianten op de gemanipuleerde Locus bijdragen aan de eigenschap van belang, aangezien varianten op de Locus het enige genetische verschil zijn tussen de wederkerige hemizygote stammen. Op deze manier is het mogelijk om genetische verschillen tussen soorten te koppelen aan een fenotypische verschil tussen hen in een goed gecontroleerde experimentele opstelling. Tot op heden zijn de toepassingen van deze test in een kandidaat-gen-kader geweest — dat wil doen, gevallen waarin de hypothese al in de hand is dat een natuurlijke variatie op een kandidaat-locus van invloed kan zijn op een eigenschap.
In wat volgt, we leggen het protocol voor een genoom schaal wederzijdse hemizygosity scherm, met behulp van gist als een modelsysteem. Onze methode creëert een genomische aanvulling van hemizygote mutanten door levensvatbare, steriele F1-hybriden te genereren tussen soorten en ze te onderwerpen aan transposon-mutagenese. We pool de hemizygoten, meten hun fenotypes in sequentiegebaseerde testen en testen op verschillen in frequentie tussen de klonen van het zwembad met de allelen van een bepaald gen van de twee ouders. Het resultaat is een catalogus van loci waarbij varianten tussen soorten invloed hebben op de eigenschap van belang. We implementeren de RH-SEQ workflow om te verhelderen de genetische basis van thermotolerance verschillen tussen twee ontluikende gist soorten, Saccharomyces cerevisiae en S. paradoxus, die omgeleid ~ 5.000.000 jaar geleden6.
De voordelen van de RH-SEQ ten opzichte van eerdere statistische-genetische methoden zijn meerdere malen. In tegenstelling tot de koppeling-en associatie analyse, biedt de RH-SEQ een single-gen mapping-resolutie; als zodanig, het zal waarschijnlijk van belangrijk nut zijn, zelfs in studies van eigenschap variatie over individuen van een bepaalde soort, evenals interspecifieke verschillen. Ook, eerdere pogingen tot genoom-brede wederzijdse hemizygosity analyse gebruikt verzamelingen van gendeletie mutanten, waarvan sommig…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken J. Roop, R. Hackley, I. Grigoriev, A. Arkin en J. Skerker voor hun bijdragen aan de oorspronkelijke studie, F. AlZaben, A. Flury, G. Geiselman, J. Hong, J. Kim, M. Maurer, en L. Oltrogge voor technische bijstand, D. Savage voor zijn vrijgevigheid met microscopie bronnen, en B. Blackman, S. Coradetti, A. Flamholz, V. Guacci, D. Koshland, C. Nelson, en A. Sasikumar voor discussies; We danken ook J. dueber (Department of Bioengineering, UC Berkeley) voor de PiggyBac plasmide. Dit werk werd ondersteund door R01 GM120430-a1 en door communautaire sequencing project 1460 aan RBB op het Amerikaanse ministerie van energie joint Genome Institute, een DOE kantoor van Science user facility. Het werk van deze laatste werd gesteund door het kantoor van de wetenschap van het Amerikaanse ministerie van energie onder contract nr. DE-AC02-05CH11231.
1-2 plasmid Gigaprep kits | Zymo Research | D4204 | The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA. |
10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
1M LiOAc | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
300 mg/mL Geneticin (G418) | Gibco | 11811023 | |
52% polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | 1546547 | Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer |
Autoclaved LB liquid broth | BD Difco | 244620 | Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use. |
Carbenicillin stock in water (100 mg/mL) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA] | 5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco | 5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919 | |
DMSO | Any | N/A | |
E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
Illumina Hiseq 2500 | used for SE-150 reads | ||
Large shaking incubators with variable temperature settings | Any | N/A | |
LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying. |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Qubit Fluorimeter | Thermo Scientific | Q33240 | |
Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
Water bath at 39°C | Any | N/A | |
Yeast fungal gDNA prep kit | Zymo Research | D6005 | |
Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media | BD Difco | Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750 | Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving. |
YPD + G418 agar plates (300 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying. |
YPD agar plates | Agar: BD Difco | Agar: 214010 |