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Biology

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

Published: October 15, 2019
doi:
10.3791/59980
, , ,
1Department of Pathology,University of Iowa, 2Medical Scientist Training Program,University of Iowa, 3Graduate Program in Immunology,University of Iowa, 4Graduate Program in Molecular Medicine,University of Iowa

Summary

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

Abstract

인간의 창 자 음식 대사 등 생리 기능을 지 워 하는 박테리아의 수조에 의해 식민지화, 에너지 수확, 그리고 면역 체계의 규칙. 건강한 장내 미생물군유전체의 교란은 다발성 경화증(MS)을 포함한 염증성 질환의 발병에 역할을 하는 것으로 제안되었다. 환경 및 유전 적 요인은 미생물군유전체의 조성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 질병 표현형과 연결된 미생물 군사회의 확인은 건강과 질병에 있는 미생물군유전체의 역할을 정의하는 쪽으로 첫번째 단계가 되었습니다. 세균 성 커뮤니티 프로파일링을 위한 16S rRNA 메타지놈 시퀀싱의 사용은 미생물군유전체 연구를 발전시키는 데 도움이 되었습니다. 그것의 넓은 사용에도 불구하고, 16S rRNA 기지를 둔 분류학 프로파일링 분석을 위한 균일한 프로토콜은 없습니다. 또 다른 한계는 작은 시퀀싱 읽기와 같은 기술적 어려움으로 인한 분류학적 할당의 낮은 해상도뿐만 아니라 역방향(R2) 읽기의 낮은 품질로 인해 최종 분석에서 만 전달(R1)의 사용이 읽힌다. 주어진 생물 표본에서 세균의 다양성을 특성화하기 위해 고해상도로 단순화 된 방법이 필요합니다. 고해상도에서 더 이상 읽기를 순서대로 정렬할 수 있는 시퀀싱 기술의 발전은 이러한 과제를 극복하는 데 도움이 되었습니다. 현재시퀀싱 기술은 R 기반 분열 Amplicon Denoising 알고리즘-2(DADA2)와 같은 공개적으로 이용 가능한 메타지노믹 분석 파이프라인과 결합되어 다다2가 속에서 서열을 할당할 수 있기 때문에 고해상도에서 미생물 프로파일링을 진행하는 데 도움이 되었습니다. 종 수준. 여기서 설명된 것은 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역의 2단계 증폭을 이용하여 세균 프로파일링을 수행하기 위한 가이드이며, 이어서 자유롭게 이용 가능한 분석 도구(즉, DADA2, Phyloseq 및 METAGENassist)를 사용하여 분석한다. 이 간단하고 완전한 워크플로우가 미생물군유전체 프로파일링 연구에 관심이 있는 연구자들을 위한 훌륭한 도구가 될 것으로 믿습니다.

Introduction

미생물은 특정 환경에 서식하는 미생물(박테리아, 바이러스, 고고학, 박테리오파지 및 곰팡이)의 집합체를 말하며, 미생물군유전체는 상주 미생물의 집단 게놈을 의미한다. 박테리아는 인간과 마우스에 있는 가장 풍부한 세균의 한개이기 때문에, 이 연구 결과는 세균성 프로파일링에만 집중됩니다. 인간의 창 자 박테리아와 세균 균의 수백의 수조에 의해식민지화 1. 정상적인 장내 미생물은 기능 조절(즉, 그대로 장 장벽 유지, 식품 대사, 에너지 항상성, 병원성 유기체에 의한 식민지화 억제) 및 면역 반응의 조절)2,3,4,5. 창자 미생물의 조성 섭동(gut dysbiosis)은 위장장애6,비만7,8,뇌졸중9,암10,위장장애 등 다수의 인간 질환과 관련이 있다. 당뇨병8,11,류마티스 관절염12,알레르기13,다발성 경화증 (MS)14,15 및 알츠하이머병과 같은 중추 신경계 관련 질환 질병 (AD)8,16. 따라서, 최근에는, 다른 바디 사이트에 세균성 조성물을 확인하기 위한 공구에 대한 관심이 증가하고 있다. 신뢰할 수 있는 방법은 처리량이 높고 사용하기 쉬운 방법, 고분해능으로 세균성 미생물을 분류하는 능력, 저비용 인 것과 같은 특성을 가져야 합니다.

배양 기반 의 미생물 학적 기술은 문화에서 성장하는 여러 장내 박테리아의 실패로 인해 복잡한 창자 미생물군유전체를 식별하고 특성화할 만큼 민감하지 않습니다. 시퀀싱 기반 기술, 특히 16S rRNA 기반 의 metagenomic 시퀀싱의 출현은 이러한 과제 중 일부를 극복하고 미생물군유전체 연구17을변화시켰다. 고급 16S rRNA 기반 시퀀싱 기술은 인간의 건강에 있는 창자 미생물군유전체에 대한 중요한 역할을 확립하는 데 도움이 되었습니다. 인간 미생물군유전체 프로젝트, 국립 보건원 이니셔티브18,메타히트 프로젝트(유럽 이니셔티브)19는 모두 미생물군유전체 분석을 위한 기본 프레임워크를 수립하는 데 도움을 주었습니다. 이러한 이니셔티브는 인간의 건강과 질병에 있는 창자 microbiome의 역할을 결정하기 위하여 다중 연구 결과를 걷어차는 것을 도왔습니다.

많은 그룹이 염증성 질환 환자에서 장 이영양증을12,14,15,20,21,22로나타났습니다. 멀티플렉스 및 저비용으로 인해 분류학적 프로파일링에 널리 사용되고 있음에도 불구하고 16S rRNA 기반 분류학적 프로파일링을 위한 균일한 프로토콜은 없습니다. 또 다른 제한은 작은 시퀀싱 읽기 (150 bp 또는 250 bp)로 인해 분류 학적 할당의 낮은 해상도와 낮은 품질의 역시퀀싱 읽기 (R2)로 인해 정방향 시퀀싱 읽기 (R1)의 사용입니다. 그러나 시퀀싱 기술의 발전은 페어링 된 끝 읽기 (예 : Illumina MiSeq 2x300bp)를 사용하여 더 이상 읽기를 순서를 정하는 기능과 같은 몇 가지 문제를 극복하는 데 도움이되었습니다.

현재의 시퀀싱 기술은 600bp의 양질의 읽기를 시퀀싱할 수 있어 R1및 R2 판독을 병합할 수 있습니다. 이러한 병합 된 더 이상 R1 및 R2 읽기는 특히 오픈 액세스 R 기반 분열 앰플리온 디노이징 알고리즘-2 (DADA2) 플랫폼과 함께, 더 나은 분류학적 할당을 할 수 있습니다. DADA2는 QIIME23에서사용하는 97%의 유사성을 기반으로 운영 분류 장치(OTU) 할당 대신 앰플리톤 서열 변형(ASV) 기반 할당을 사용합니다. ASV 일치는 속과 종 수준에 할당에 이르게 1-2 뉴클레오티드 내에서 데이터베이스에서 정확한 서열 일치를 초래한다. 따라서, 더 길고, 좋은 품질의 페어링 엔드 읽기와 더 나은 분류학적 할당 도구(예: DADA2)의 조합은 미생물군유전체 연구를 변화시켰습니다.

여기에 제공된 16S rRNA의 V3-V4 영역의 2단계 증폭및 DADA2, Phyloseq 및 METAGENassist 파이프라인을 사용한 데이터 분석을 사용하여 세균 프로파일링을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제공됩니다. 본 연구를 위해, 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 형질전환 마우스가 사용되고, 특정 HLA 클래스 II 알레르는 MS20,24,25와같은 자가면역 질환에 대한 경향과 연결된다. 그러나, 창 자 microbiota의 구성을 조절에 HLA 클래스 II 유전자의 중요성은 알 수 없습니다. HLA 클래스 II 분자는 특정 박테리아를 선택하여 창자 미생물 커뮤니티에 영향을 미칠 것이라고 가설. 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 II 녹아웃 마우스(AE.KO) 또는 인간 HLA-DQ8 분자(HLA-DQ8)24,25,26을 발현하는 마우스에서 HLA 클래스 II 분자의 중요성을 이해하기 위해 사용되었다. 창자 미생물 커뮤니티를 형성. R 기반 데이터 분석을 통해 완전하고 간소화된 워크플로우가 미생물군유전체 프로파일링 연구를 수행하는 데 관심이 있는 연구자를 위한 훌륭한 도구가 될 것으로 믿습니다.

내인성 뮤린 MHC 클래스 II 유전자(AE.KO) 및AE-/-결여된 마우스의 생성. HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) C57BL/6J 배경을 가진 형질전환 마우스는 앞서26에기재되어 있다. 배설물 샘플은 남녀 모두의 마우스에서 수집됩니다 (8-12 나이의 주). 마우스는 이전에 NIH 및 기관 지침에 따라 아이오와 대학 동물 시설에서 사육 및 유지되었습니다. 층류 캐비닛 내부에 마우스의 이유비, 마우스의 다른 변종 사이 장갑의 변경 및 마우스의 적당한 유지와 같은 오염 통제 전략은 창자 microbiome의 프로파일링을 위한 중요한 단계입니다.

적절한 개인 보호 장비 (PPE)는 전체 절차 중에 적극 권장됩니다. DNA 절연, PCR1 및 PCR2 증폭 및 시퀀싱 단계를 수행할 때 적절한 음성 제어가 포함되어야 합니다. 멸균, DNase 프리, RNase 및 파이로겐이 없는 소모품을 사용하는 것이 좋습니다. 미생물군유전체 작업및 여과된 파이펫 팁을 위한 지정된 피펫터는 프로토콜 전반에 걸쳐 사용해야 합니다. Microbiota 분석은 7단계로 이루어져 있습니다: 1) 대변 샘플 수집 및 처리; 2) DNA의 추출; 3) 16S rRNA 유전자 증폭; 4) 인덱싱된 PCR을 이용한 DNA 라이브러리 구축; 5) 인덱싱된 PCR(라이브러리)의 정리 및 정량화; 6) 미세크 시퀀싱; 및 7) 데이터 처리 및 시퀀스 분석. 모든 프로토콜 단계의 회로도다이어는 그림 1에나와 있습니다.

Protocol

이 프로토콜은 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 배설물 샘플 수집 및 취급 70% 에탄올로 디바이더 박스(재료 표, 보충 그림 1참조)를 살균합니다. 샘플 ID 및 처리 그룹(해당하는 경우)과 함께 미세원심분리튜브(마우스당 1개)를 사전 라벨을 붙인다. 생쥐를 멸균된 칸막이 상자에 놓고 최대…

Representative Results

MHC 클래스 II 분자(인간HLA)는 적응형 면역 반응의 중심적인 플레이어이며 MS24,25,26에대한 경향과의 강한 연관성을 나타내고, HLA 클래스 II 분자가 있다고 가설하였다. 장 내 미생물 구성에 영향을 미칠 것 이다. 따라서, MHC 클래스 II 유전자(AE.KO) 또는 발현하는 인간 HLA-DQ8 유전자(HLA-DQ8)가 결여된 마우스는 장내 미생물 군을 형성?…

Discussion

기재된 프로토콜은 많은 수의 생물표본으로부터 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱을 사용하여 미생물군유전체 프로파일링을 수행하기 쉬운 단계로 간단합니다. 차세대 염기서열 분석은 특히 인간 및 전임상 질환 모델31,32에서미생물 생태학 연구를 변화시켰다. 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량 수준과 저렴한 비용32에서주어진 생물 표본에?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 NIAID /NIH (1R01AI137075-01), 카버 트러스트 의학 연구 이니셔티브 보조금, 아이오와 환경 건강 과학 연구 센터, NIEHS / NIH (P30 ES005605)의 자금 지원을 인정합니다.

Materials

1.5 ml Natural Microcentriguge Tube USA, Scientific 1615-5500 Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G 3M, MN, US 7100038651 Squeeger for proper sealing of PCR Plate
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter, IN, USA A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
Agilent DNA 1000 REAGENT Agilent Technologies, CA, USA 5067-1504 DNA quantification and quality control
Bioanalyzer DNA 1000 chip Agilent Technologies, CA, USA 5067-1504 DNA quantification and quality control
Index Adopter Replacement Caps Illumina, Inc., CA, USA 15026762 New cap for Index 1 and 2 adopter primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA 12855-100 DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) Kapa Biosystem, MA, USA KK2602 PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2
Lewis Divider Boxes Lewis Bins, WI, US ND03080 Fecal collection
Magnetic stand New England BioLabs, MA, USA S1509S For PCR clean-up
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA 4346906 PCR Plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA 4311971 PCR Plate Sealer
Microfuge 20 Centrifuge Beckman Coulter, IN, USA B30154 Centrifuge used for DNA isolation
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 Illumina, Inc., CA, USA MS-102-3003 For MiSeq Sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina, Inc., CA, USA FC-131-1001 16S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel Trays ASI, FL,USA RS71-1 For Pooling of PCR2 Product
Plate Cetrifuge Thermo Fisher Scientific, CA, USA 75004393 For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate
PhiX Control Illumina, Inc., CA, USA FC-110-3001 For MiSeq Sequencing control
Microbiome DNA Purification Kit Thermo Fisher Scientific, CA, USA A29789 For purification of PCR1 product
PowerLyzer 24 Homogenizer Omni International, GA, USA 19-001 Bead beater for DNA Isolation
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit Thermo Fisher Scientific, CA, USA Q32854 DNA quantification
TruSeq Index Plate Fixture Illumina, Inc., CA, USA FC-130-1005 For Arranging of the index primers
Vertical Dividers (large) Lewis Bins, WI, US DV-2280 Fecal collection
Vertical Dividers (small) Lewis Bins, WI, US DV-1780 Fecal collection
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References

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Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N. V., Mangalam, A. K. Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing. J. Vis. Exp. (152), e59980, doi:10.3791/59980 (2019).
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