JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Bakterieflora analyse ved hjelp av to-trinns PCR og neste generasjons 16S rRNA Gene sekvensering

Published: October 15, 2019
doi:
10.3791/59980
, , ,
1Department of Pathology,University of Iowa, 2Medical Scientist Training Program,University of Iowa, 3Graduate Program in Immunology,University of Iowa, 4Graduate Program in Molecular Medicine,University of Iowa

Summary

Beskrevet her er en forenklet standard driftsprosedyre for mikrobiomet profilering bruker 16S rRNA metagenomic sekvensering og analyse ved hjelp av fritt tilgjengelige verktøy. Denne protokollen vil hjelpe forskere som er nye til mikrobiomet feltet så vel som de som krever oppdateringer på metoder for å oppnå bakteriell profilering på en høyere oppløsning.

Abstract

Den menneskelige gut er kolonisert av billioner av bakterier som støtter fysiologiske funksjoner som mat metabolisme, energihøsting, og regulering av immunsystemet. Forstyrrelsene av sunne gut mikrobiomet har blitt foreslått å spille en rolle i utviklingen av inflammatoriske sykdommer, inkludert multippel sklerose (MS). Miljømessige og genetiske faktorer kan påvirke sammensetningen av mikrobiomet; Derfor identifisering av mikrobielle samfunn knyttet til en sykdom fenotype har blitt det første skrittet mot å definere mikrobiomet rolle i helse og sykdom. Bruk av 16S rRNA metagenomic sekvensering for profilering bakteriell samfunnet har bidratt i fremmarsj mikrobiomet forskning. Til tross for bred bruk, er det ingen enhetlig protokoll for 16S rRNA-baserte taksonomisk profilering analyse. En annen begrensning er det lav resolution av taksonomisk vervet på grunn av teknisk vanskeligheter som mindre sekvensering leser, likeledes idet bruk av bare videresende (R1) leser inne det final analyse på grunn av lav kvalitet av det omvendte (R2) leser. Det er behov for en forenklet metode med høy oppløsning for å karakterisere bakteriell mangfold i en gitt biospecimen. Fremskritt i sekvensering teknologi med evnen til sekvensen lengre leser i høy oppløsning har bidratt til å overvinne noen av disse utfordringene. Present sekvensering teknologi kombinert med en offentlig tilgjengelig metagenomic analyse rørledning som R-basert splittende Amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2) har bidratt til å fremme mikrobiell profilering ved høy oppløsning, som DADA2 kan tildele sekvens på slekten og arter nivåer. Beskrevet her er en guide for å utføre bakteriell profilering ved hjelp av to-trinns forsterkning av v3-v4 regionen av 16S rRNA genet, etterfulgt av analyse ved hjelp av fritt tilgjengelige analyseverktøy (dvs. DADA2, Phyloseq, og METAGENassist). Det antas at denne enkle og komplette arbeidsflyten vil tjene som et utmerket verktøy for forskere interessert i å utføre mikrobiomet profilering studier.

Introduction

Bakterieflora refererer til en samling av mikroorganismer (bakterier, virus, Archaea, bacteriophages, og sopp) som lever i et bestemt miljø, og mikrobiomet refererer til den kollektive Genova av bosatt mikroorganismer. Som bakterier er en av de mest tallrike mikrober hos mennesker og mus, denne studien er fokusert bare på bakteriell profilering. Den menneskelige gut er kolonisert av billioner av bakterier og hundrevis av bakterielle stammer1. Den normale gut bakterieflora spiller en viktig rolle i å opprettholde en sunn tilstand i verten ved å regulere funksjoner (dvs. vedlikehold av en intakt intestinal barriere, mat metabolisme, energi homeostase, hemming av kolonisering av patogene organismer, og regulering av immunresponser)2,3,4,5. Forstyrrelser av tarmen bakterieflora (gut dysbiosis) har vært knyttet til en rekke menneskelige sykdommer, inkludert gastrointestinale lidelser6, fedme7,8, hjerneslag9, kreft10, diabetes8,11, revmatoid artritt12, allergi13, og sentrale nervesystemet-relaterte sykdommer som multippel sklerose (MS)14,15 og Alzheimers sykdom (AD)8,16. Derfor, i de senere årene, har det vært økende interesse for verktøy for å identifisere bakteriell sammensetning på ulike kroppens nettsteder. En pålitelig metode bør ha egenskaper som å være høy gjennomstrømming og lett å bruke, har evnen til å klassifisere bakteriell bakterieflora med høy oppløsning, og å være lave kostnader.

Kultur-baserte mikrobiologisk teknikker er ikke følsomme nok til å identifisere og karakterisere den komplekse gut mikrobiomet på grunn av svikt i flere tarmbakterier å vokse i kultur. Advent av sekvensering-basert teknologi, spesielt 16S rRNA-baserte metagenomic sekvensering, har overvunnet noen av disse utfordringene og forvandlet mikrobiomet forskning17. Avansert 16S rRNA-baserte sekvensering teknologi har bidratt i å etablere en kritisk rolle for tarmen mikrobiomet i menneskers helse. The Human Mikrobiomet Project, en National Institutes of Health initiativ18, og MetaHIT prosjektet (et europeisk initiativ)19 har begge bidratt i å etablere en grunnleggende rammeverk for mikrobiomet analyse. Disse initiativene hjalp kick-starte flere studier for å bestemme hvilken rolle tarmen mikrobiomet i menneskers helse og sykdom.

En rekke grupper har vist gut dysbiosis hos pasienter med inflammatoriske sykdommer12,14,15,20,21,22. Til tross for tilværelse vidt anvendt for taksonomisk profilering på grunn av evnen å multiplex og lav omkostningene, der er nei uniform protokoller for 16S rRNA-basert taksonomisk profilering. En annen begrensning er den lave oppløsningen av taksonomisk oppdrag på grunn av mindre sekvensering leser (150 BP eller 250 BP) og bruk av bare fremover sekvensering lese (R1) på grunn av lav kvalitet omvendt sekvensering leser (R2). Men fremskritt i sekvensering teknologi har bidratt til å overvinne noen av disse utfordringene, for eksempel muligheten til å sekvens lenger leser bruker sammenkoblet-end leser (f. eks Illumina MiSeq 2x300bp).

Den nåværende sekvensering teknologien kan sekvensen 600 BP god kvalitet leser, som tillater sammenslåing av R1 og R2 leser. Disse fusjonerte lenger R1 og R2 leser tillate bedre taksonomisk oppgaver, spesielt med Open-Access R-baserte splittende Amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2) plattform. DADA2 bruker amplicon-baserte tilordninger i stedet for taksonomisk-tilordninger (OTU) basert på 97% likhet som brukes av QIIME23. ASV-kamper resulterer i en eksakt sekvens kamp i databasen innen 1 – 2 nukleotider, noe som fører til oppdrag på slekten og Arts nivå. Dermed har kombinasjonen av lengre, god kvalitet sammenkoblet-end leser og bedre taksonomisk oppdrag verktøy (for eksempel DADA2) forvandlet mikrobiomet studier.

Forutsatt her er en steg-for-steg guide for å utføre bakteriell profilering ved hjelp av to-trinns forsterkning av v3-v4 regionen 16S rRNA og dataanalyse ved hjelp av DADA2, Phyloseq, og METAGENassist rørledninger. For denne studien, Human leukocytter antigen (HLA) klasse II transgene mus brukes, som enkelte HLA klasse II alleler er koblet med en predisposisjon for autoimmune sykdommer som MS20,24,25. Men betydningen av HLA klasse II gener i å regulere sammensetningen av gut bakterieflora er ukjent. Det er hypotetisk gjennomsnitt at HLA klasse II molekylet vil påvirke gut mikrobiell samfunnet ved å velge for spesifikke bakterier. Major histocompatibility Complex (MHC) klasse II knockout mus (AE. ko) eller mus uttrykker menneskelige HLA-DQ8 molekyler (HLA-DQ8)24,25,26 ble brukt for å forstå viktigheten av HLA klasse II molekyler i forme tarmen mikrobielle samfunnet. Det antas at denne komplette og forenklede arbeidsflyten med R-baserte dataanalyse vil tjene som et utmerket verktøy for forskere interessert i å utføre mikrobiomet profilering studier.

Generering av mus mangler endogene murine MHC klasse II gener (AE. KO) og AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) transgene mus med en C57BL/6J bakgrunn har blitt beskrevet tidligere26. Avføringsprøver er samlet fra mus av begge kjønn (8 – 12 ukers alder). Mus ble tidligere avlet og vedlikeholdt i University of Iowa dyr anlegget i henhold til NIH og institusjonelle retningslinjer. Forurensning kontroll strategier som avvenning av mus inne i en laminær Flow kabinett, endring av hansker mellom ulike stammer av mus, og riktig vedlikehold av mus er kritiske skritt for profilering av gut mikrobiomet.

Riktig personlig verneutstyr (PPE) anbefales sterkt under hele prosedyren. Passende negativ kontroller bør inkluderes når du utfører DNA-isolasjon, PCR1 og PCR2 forsterkning, og sekvensering trinn. Bruk av sterile, DNase frie, RNase frie og pyrogene forsyninger anbefales. Utpekte pipettehjelper for mikrobiomet arbeid og filtrerte pipette tips bør brukes gjennom hele protokollen. Bakterieflora analyse består av sju trinn: 1) avføringsprøve samling og prosessering; 2) utvinning av DNA; 3) 16S rRNA gen forsterkning; 4) DNA bibliotek konstruksjon ved hjelp av indeksert PCR; 5) opprydding og kvantifisering av indeksert PCR (bibliotek); 6) MiSeq sekvensering; og 7) databehandling og sekvens analyse. Et skjematisk diagram over alle protokoll trinnene er vist i figur 1.

Protocol

Protokollen ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Iowa. 1. avførings sample innsamling og håndtering Sterilisere skille boksene (se tabell over materialer, supplerende figur 1) med 70% etanol. Forhånds etikett mikrosentrifugen rør (én per mus) med eksempel-ID og behandlingsgruppe (hvis aktuelt). Plasser musene i sterilisert skille bokser og la dem defekt normalt i opptil 1 time. <…

Representative Results

Som MHC klasse II molekyler (HLA hos mennesker) er sentrale aktører i adaptive immunrespons og vise sterke assosiasjoner med en predisposisjon for MS24,25,26, var det hypotetisk gjennomsnitt at HLA klasse II molekyl ville påvirke gut mikrobiell komposisjon. Derfor mus mangler MHC klasse II genet (AE. KO) eller uttrykke menneskelige HLA-DQ8 genet (HLA-DQ8) ble benyttet for å forstå viktigheten av HLA klasse II molekyler i utf…

Discussion

Den beskrevne protokollen er enkel, med lett-å-følge trinn for å utføre mikrobiomet profilering bruker 16S rRNA metagenomic sekvensering fra et stort antall biospecimens av interesse. Neste generasjons sekvensering har transformert mikrobiell økologi studier, spesielt i Human og pre-klinisk sykdom modeller31,32. Den største fordelen med denne teknikken er dens evne til å lykkes analysere komplekse mikrobielle komposisjoner (culturable og ikke-culturable mi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne erkjenner finansiering fra NIAID/NIH (1R01AI137075-01), den Carver Trust Medical Research Initiative Grant, og University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

Materials

1.5 ml Natural Microcentriguge Tube USA, Scientific 1615-5500 Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G 3M, MN, US 7100038651 Squeeger for proper sealing of PCR Plate
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter, IN, USA A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
Agilent DNA 1000 REAGENT Agilent Technologies, CA, USA 5067-1504 DNA quantification and quality control
Bioanalyzer DNA 1000 chip Agilent Technologies, CA, USA 5067-1504 DNA quantification and quality control
Index Adopter Replacement Caps Illumina, Inc., CA, USA 15026762 New cap for Index 1 and 2 adopter primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA 12855-100 DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) Kapa Biosystem, MA, USA KK2602 PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2
Lewis Divider Boxes Lewis Bins, WI, US ND03080 Fecal collection
Magnetic stand New England BioLabs, MA, USA S1509S For PCR clean-up
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA 4346906 PCR Plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA 4311971 PCR Plate Sealer
Microfuge 20 Centrifuge Beckman Coulter, IN, USA B30154 Centrifuge used for DNA isolation
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 Illumina, Inc., CA, USA MS-102-3003 For MiSeq Sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina, Inc., CA, USA FC-131-1001 16S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel Trays ASI, FL,USA RS71-1 For Pooling of PCR2 Product
Plate Cetrifuge Thermo Fisher Scientific, CA, USA 75004393 For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate
PhiX Control Illumina, Inc., CA, USA FC-110-3001 For MiSeq Sequencing control
Microbiome DNA Purification Kit Thermo Fisher Scientific, CA, USA A29789 For purification of PCR1 product
PowerLyzer 24 Homogenizer Omni International, GA, USA 19-001 Bead beater for DNA Isolation
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit Thermo Fisher Scientific, CA, USA Q32854 DNA quantification
TruSeq Index Plate Fixture Illumina, Inc., CA, USA FC-130-1005 For Arranging of the index primers
Vertical Dividers (large) Lewis Bins, WI, US DV-2280 Fecal collection
Vertical Dividers (small) Lewis Bins, WI, US DV-1780 Fecal collection
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
  2. Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
  3. Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
  4. Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
  5. Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
  6. Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
  7. Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
  8. Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer’s disease. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
  9. Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
  10. Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
  11. Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
  12. Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
  13. Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
  14. Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
  15. Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
  16. Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
  17. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, 4516-4522 (2011).
  18. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
  19. Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, 23-28 (2010).
  20. Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
  21. Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
  22. Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
  25. Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
  26. Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
  27. Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn’s & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
  28. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
  29. Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
  30. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
  31. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
  32. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
  33. Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
  34. Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
  35. Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
  36. Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
  37. Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
  38. Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
  39. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
  41. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
  42. Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
  43. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
  44. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  45. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
  46. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
  47. Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
  48. Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
  49. Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).

Tags

MicrobiomeMicrobiota16S RRNA Gene SequencingNext-generation SequencingFecal SampleDNA ExtractionPCRGut MicrobiomeMicrobial Profiling
check_url/59980?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N. V., Mangalam, A. K. Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing. J. Vis. Exp. (152), e59980, doi:10.3791/59980 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image