Beskrevet her er en forenklet standard driftsprosedyre for mikrobiomet profilering bruker 16S rRNA metagenomic sekvensering og analyse ved hjelp av fritt tilgjengelige verktøy. Denne protokollen vil hjelpe forskere som er nye til mikrobiomet feltet så vel som de som krever oppdateringer på metoder for å oppnå bakteriell profilering på en høyere oppløsning.
Den menneskelige gut er kolonisert av billioner av bakterier som støtter fysiologiske funksjoner som mat metabolisme, energihøsting, og regulering av immunsystemet. Forstyrrelsene av sunne gut mikrobiomet har blitt foreslått å spille en rolle i utviklingen av inflammatoriske sykdommer, inkludert multippel sklerose (MS). Miljømessige og genetiske faktorer kan påvirke sammensetningen av mikrobiomet; Derfor identifisering av mikrobielle samfunn knyttet til en sykdom fenotype har blitt det første skrittet mot å definere mikrobiomet rolle i helse og sykdom. Bruk av 16S rRNA metagenomic sekvensering for profilering bakteriell samfunnet har bidratt i fremmarsj mikrobiomet forskning. Til tross for bred bruk, er det ingen enhetlig protokoll for 16S rRNA-baserte taksonomisk profilering analyse. En annen begrensning er det lav resolution av taksonomisk vervet på grunn av teknisk vanskeligheter som mindre sekvensering leser, likeledes idet bruk av bare videresende (R1) leser inne det final analyse på grunn av lav kvalitet av det omvendte (R2) leser. Det er behov for en forenklet metode med høy oppløsning for å karakterisere bakteriell mangfold i en gitt biospecimen. Fremskritt i sekvensering teknologi med evnen til sekvensen lengre leser i høy oppløsning har bidratt til å overvinne noen av disse utfordringene. Present sekvensering teknologi kombinert med en offentlig tilgjengelig metagenomic analyse rørledning som R-basert splittende Amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2) har bidratt til å fremme mikrobiell profilering ved høy oppløsning, som DADA2 kan tildele sekvens på slekten og arter nivåer. Beskrevet her er en guide for å utføre bakteriell profilering ved hjelp av to-trinns forsterkning av v3-v4 regionen av 16S rRNA genet, etterfulgt av analyse ved hjelp av fritt tilgjengelige analyseverktøy (dvs. DADA2, Phyloseq, og METAGENassist). Det antas at denne enkle og komplette arbeidsflyten vil tjene som et utmerket verktøy for forskere interessert i å utføre mikrobiomet profilering studier.
Bakterieflora refererer til en samling av mikroorganismer (bakterier, virus, Archaea, bacteriophages, og sopp) som lever i et bestemt miljø, og mikrobiomet refererer til den kollektive Genova av bosatt mikroorganismer. Som bakterier er en av de mest tallrike mikrober hos mennesker og mus, denne studien er fokusert bare på bakteriell profilering. Den menneskelige gut er kolonisert av billioner av bakterier og hundrevis av bakterielle stammer1. Den normale gut bakterieflora spiller en viktig rolle i å opprettholde en sunn tilstand i verten ved å regulere funksjoner (dvs. vedlikehold av en intakt intestinal barriere, mat metabolisme, energi homeostase, hemming av kolonisering av patogene organismer, og regulering av immunresponser)2,3,4,5. Forstyrrelser av tarmen bakterieflora (gut dysbiosis) har vært knyttet til en rekke menneskelige sykdommer, inkludert gastrointestinale lidelser6, fedme7,8, hjerneslag9, kreft10, diabetes8,11, revmatoid artritt12, allergi13, og sentrale nervesystemet-relaterte sykdommer som multippel sklerose (MS)14,15 og Alzheimers sykdom (AD)8,16. Derfor, i de senere årene, har det vært økende interesse for verktøy for å identifisere bakteriell sammensetning på ulike kroppens nettsteder. En pålitelig metode bør ha egenskaper som å være høy gjennomstrømming og lett å bruke, har evnen til å klassifisere bakteriell bakterieflora med høy oppløsning, og å være lave kostnader.
Kultur-baserte mikrobiologisk teknikker er ikke følsomme nok til å identifisere og karakterisere den komplekse gut mikrobiomet på grunn av svikt i flere tarmbakterier å vokse i kultur. Advent av sekvensering-basert teknologi, spesielt 16S rRNA-baserte metagenomic sekvensering, har overvunnet noen av disse utfordringene og forvandlet mikrobiomet forskning17. Avansert 16S rRNA-baserte sekvensering teknologi har bidratt i å etablere en kritisk rolle for tarmen mikrobiomet i menneskers helse. The Human Mikrobiomet Project, en National Institutes of Health initiativ18, og MetaHIT prosjektet (et europeisk initiativ)19 har begge bidratt i å etablere en grunnleggende rammeverk for mikrobiomet analyse. Disse initiativene hjalp kick-starte flere studier for å bestemme hvilken rolle tarmen mikrobiomet i menneskers helse og sykdom.
En rekke grupper har vist gut dysbiosis hos pasienter med inflammatoriske sykdommer12,14,15,20,21,22. Til tross for tilværelse vidt anvendt for taksonomisk profilering på grunn av evnen å multiplex og lav omkostningene, der er nei uniform protokoller for 16S rRNA-basert taksonomisk profilering. En annen begrensning er den lave oppløsningen av taksonomisk oppdrag på grunn av mindre sekvensering leser (150 BP eller 250 BP) og bruk av bare fremover sekvensering lese (R1) på grunn av lav kvalitet omvendt sekvensering leser (R2). Men fremskritt i sekvensering teknologi har bidratt til å overvinne noen av disse utfordringene, for eksempel muligheten til å sekvens lenger leser bruker sammenkoblet-end leser (f. eks Illumina MiSeq 2x300bp).
Den nåværende sekvensering teknologien kan sekvensen 600 BP god kvalitet leser, som tillater sammenslåing av R1 og R2 leser. Disse fusjonerte lenger R1 og R2 leser tillate bedre taksonomisk oppgaver, spesielt med Open-Access R-baserte splittende Amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2) plattform. DADA2 bruker amplicon-baserte tilordninger i stedet for taksonomisk-tilordninger (OTU) basert på 97% likhet som brukes av QIIME23. ASV-kamper resulterer i en eksakt sekvens kamp i databasen innen 1 – 2 nukleotider, noe som fører til oppdrag på slekten og Arts nivå. Dermed har kombinasjonen av lengre, god kvalitet sammenkoblet-end leser og bedre taksonomisk oppdrag verktøy (for eksempel DADA2) forvandlet mikrobiomet studier.
Forutsatt her er en steg-for-steg guide for å utføre bakteriell profilering ved hjelp av to-trinns forsterkning av v3-v4 regionen 16S rRNA og dataanalyse ved hjelp av DADA2, Phyloseq, og METAGENassist rørledninger. For denne studien, Human leukocytter antigen (HLA) klasse II transgene mus brukes, som enkelte HLA klasse II alleler er koblet med en predisposisjon for autoimmune sykdommer som MS20,24,25. Men betydningen av HLA klasse II gener i å regulere sammensetningen av gut bakterieflora er ukjent. Det er hypotetisk gjennomsnitt at HLA klasse II molekylet vil påvirke gut mikrobiell samfunnet ved å velge for spesifikke bakterier. Major histocompatibility Complex (MHC) klasse II knockout mus (AE. ko) eller mus uttrykker menneskelige HLA-DQ8 molekyler (HLA-DQ8)24,25,26 ble brukt for å forstå viktigheten av HLA klasse II molekyler i forme tarmen mikrobielle samfunnet. Det antas at denne komplette og forenklede arbeidsflyten med R-baserte dataanalyse vil tjene som et utmerket verktøy for forskere interessert i å utføre mikrobiomet profilering studier.
Generering av mus mangler endogene murine MHC klasse II gener (AE. KO) og AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) transgene mus med en C57BL/6J bakgrunn har blitt beskrevet tidligere26. Avføringsprøver er samlet fra mus av begge kjønn (8 – 12 ukers alder). Mus ble tidligere avlet og vedlikeholdt i University of Iowa dyr anlegget i henhold til NIH og institusjonelle retningslinjer. Forurensning kontroll strategier som avvenning av mus inne i en laminær Flow kabinett, endring av hansker mellom ulike stammer av mus, og riktig vedlikehold av mus er kritiske skritt for profilering av gut mikrobiomet.
Riktig personlig verneutstyr (PPE) anbefales sterkt under hele prosedyren. Passende negativ kontroller bør inkluderes når du utfører DNA-isolasjon, PCR1 og PCR2 forsterkning, og sekvensering trinn. Bruk av sterile, DNase frie, RNase frie og pyrogene forsyninger anbefales. Utpekte pipettehjelper for mikrobiomet arbeid og filtrerte pipette tips bør brukes gjennom hele protokollen. Bakterieflora analyse består av sju trinn: 1) avføringsprøve samling og prosessering; 2) utvinning av DNA; 3) 16S rRNA gen forsterkning; 4) DNA bibliotek konstruksjon ved hjelp av indeksert PCR; 5) opprydding og kvantifisering av indeksert PCR (bibliotek); 6) MiSeq sekvensering; og 7) databehandling og sekvens analyse. Et skjematisk diagram over alle protokoll trinnene er vist i figur 1.
Den beskrevne protokollen er enkel, med lett-å-følge trinn for å utføre mikrobiomet profilering bruker 16S rRNA metagenomic sekvensering fra et stort antall biospecimens av interesse. Neste generasjons sekvensering har transformert mikrobiell økologi studier, spesielt i Human og pre-klinisk sykdom modeller31,32. Den største fordelen med denne teknikken er dens evne til å lykkes analysere komplekse mikrobielle komposisjoner (culturable og ikke-culturable mi…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner finansiering fra NIAID/NIH (1R01AI137075-01), den Carver Trust Medical Research Initiative Grant, og University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
1.5 ml Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |