Identifikasjon av sirkulær RNAs ved hjelp av RNA-sekvensering
Summary
Sirkulær RNAs (circRNAs) er ikke-koding RNAs som kan ha roller i transcriptional regulering og formidling interaksjoner mellom proteiner. Etter vurdering av ulike parametre for bygging av circRNA sekvensering biblioteker, en protokoll ble kompilert utnytte strandet total RNA biblioteket forberedelse med RNase R pre-behandling og er presentert her.
Abstract
Circular RNAs (circRNAs) er en klasse av ikke-koding RNAs involvert i funksjoner, inkludert Micro-RNA (miRNA) regulering, formidling av protein-protein interaksjoner, og regulering av foreldrenes genet transkripsjon. I klassisk neste generasjon RNA sekvensering (RNA-SEQ), circRNAs er vanligvis oversett som følge av Poly-et utvalg under byggingen av mRNA biblioteker, eller finnes ved svært lav overflod, og er derfor vanskelig å isolere og oppdage. Her, en circRNA biblioteket konstruksjon protokollen ble optimalisert ved å sammenligne biblioteket forberedelse kits, forbehandling alternativer og ulike totale RNA input beløp. To kommersielt tilgjengelige hele transcriptome bibliotek Forberedelses sett, med og uten RNase R forbehandling, og ved hjelp av variable mengder totalt RNA-inngang (1 til 4 μg), ble testet. Til slutt, flere vevstyper; inkludert lever, lunge, lymfe node, og bukspyttkjertel; så vel som flere hjerneregioner; inkludert lillehjernen, mindreverdig parietal flik, midt Temporal gyrus, occipital cortex, og overlegen frontal gyrus; sammenlignet med å evaluere circRNA overflod på tvers av vevstyper. Analyse av de genererte RNA-SEQ-dataene ved hjelp av seks forskjellige circRNA gjenkjenningsverktøy (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC og CIRCexplorer) avslørte at en strandet total RNA-biblioteks Forberedelses sett med RNase R forbehandling og 4 μg RNA-inngang er den optimale metode for å identifisere det høyeste relative antallet circRNAs. I samsvar med tidligere funn, den høyeste berikelse av circRNAs ble observert i hjernen vev i forhold til andre typer vev.
Introduction
Sirkulær RNAs (CircRNAs) er endogene, ikke-koding RNAs som har fått oppmerksomhet gitt deres gjennomgående uttrykk i eukaryote transcriptome1,2,3. De dannes når exoner back-skjøte til hverandre og dermed ble i utgangspunktet anses å være skjøting gjenstander4,5. Men nyere studier har vist at circRNAs utstillingen celle type, vev, og utviklingsmessige scenen spesifikke uttrykk3,6 og er evolutionarily bevart2,3. Videre er de involvert i mekling av protein-protein interaksjoner7, mikro-RNA (miRNA) binding3,8,9,10, og regulering av foreldrenes genet transkripsjon11.
I klassisk RNA sekvensering (RNA-SEQ), circRNAs kan være helt tapt under biblioteket konstruksjon som et resultat av Poly-et utvalg for mRNAs eller kan være vanskelig å isolere gitt sin lave overflod. Men nylig circRNA karakterisering studier har innarbeidet en pre-Treatment trinn ved hjelp RNase R for å berike for circRNAs2,12,13. RNase R er en exoribonuclease som fordøyer lineær RNAs, og etterlater sirkulære RNA-strukturer. CircRNA berikelse protokoller ble optimalisert ved å generere og sammenligne data fra to kommersielt tilgjengelige hele transcriptome biblioteket konstruksjon kits, med og uten en RNase R pre-Treatment trinn, og ved hjelp av varierende mengder av total RNA input (1 til 4 μg). Den optimaliserte protokollen ble neste brukt til å evaluere overflod av circRNAs over fem forskjellige hjernen regioner (lillehjernen [BC], mindreverdig parietal flik [IP], midt Temporal gyrus [MG], occipital cortex [OC] og overlegen frontal gyrus [SF]) og fire andre vev typer (lever [LV], lunge [LU], lymfeknuter [LN] og bukspyttkjertel [PA]). RNA-SEQ bibliotekene ble sammenkoblet slutten sekvensert og data ble analysert ved hjelp av seks forskjellige circRNA prediksjon algoritmer: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, Knife16, DCC17, og CIRCexplorer18. Basert på vår analyse ble det høyeste antallet unike circRNAs oppdaget ved bruk av et strandet total RNA-biblioteks Forberedelses sett med RNase R forbehandling og 4 μg total inngang RNA. Den optimaliserte protokollen er beskrevet her. Som tidligere rapportert19,20, den høyeste berikelse av circRNAs ble observert i hjernen i forhold til andre typer vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien, to kommersielt tilgjengelige bibliotek forberedelse kits, pre-behandling alternativer, og innspill RNA beløpene ble testet for å optimalisere en circRNA berikelse protokoll for bygging av circRNA sekvensering biblioteker. Basert på vurderingen til denne studien, er en rekke viktige aspekter og kritiske trinn for å opprette circRNA sekvensering biblioteker åpenbare. Vår evaluering bekrefter nytten av RNase R pre-behandling, som gjenspeiles av det økte antallet circRNAs oppdaget. Generelt sett ble d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for banner Søn Health Research Institute Brain and Body donasjon program (BBDP) av Sun City, Arizona for levering av menneskelige hjernevev. Den BBDP har blitt støttet av National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag (U24 NS072026 National Brain og vev Resource for Parkinsons sykdom og relaterte lidelser), National Institute on aging (P30AG19610 Arizona Alzheimers sykdom Core Center), Arizona Department of Health Services (kontrakt 211002, Arizona Alzheimers Research Center), Arizona Biomedical Research Commission (kontrakter 4001, 0011, 05-901 og 1001 til Arizona Parkinson ‘ s Disease Consortium) og Michael J. Fox Foundation for Parkinsons forskning27. Denne studien ble også støttet av DHS og staten Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). Vi takker også Andrea Schmitt (banner Research) og Cynthia Lechuga (TGen) for Administrativ støtte.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al. Scrambled exons. Cell. 64 (3), 607-613 (1991).
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
