Identifiering av cirkulär RNAs med RNA-sekvensering
Summary
Cirkulär RNAs (circRNAs) är icke-kodande RNAs som kan ha roller i transkriptionell reglering och förmedla interaktioner mellan proteiner. Efter bedömning av olika parametrar för byggandet av circRNA sekvenserings bibliotek, ett protokoll sammanställdes utnyttjar Stranded totalt RNA Library beredning med RNase R pre-behandling och presenteras här.
Abstract
Cirkulär RNAs (circRNAs) är en klass av icke-kodning RNAs inblandade i funktioner inklusive mikro-RNA (miRNA) reglering, medling av protein-protein interaktioner, och reglering av föräldrarnas gentranskription. I klassisk nästa generations RNA-sekvensering (RNA-SEQ) förbises circRNAs vanligtvis som ett resultat av poly-A-val under byggandet av mRNA-bibliotek, eller finns i mycket låg förekomst, och är därför svåra att isolera och upptäcka. Här, en circRNA bibliotek konstruktions protokoll optimerades genom att jämföra bibliotek förberedelse kit, pre-behandling alternativ och olika totala RNA ingångsbelopp. Två kommersiellt tillgängliga hela transkriptome bibliotek förberedelse kit, med och utan RNase R förbehandling, och med hjälp av varierande mängder av totala RNA-ingången (1 till 4 μg), testades. Slutligen, flera vävnadstyper; inklusive lever, lungor, lymfkörtel, och bukspottkörteln; och flera hjärnregioner; inklusive lillhjärnan, sämre parietallob, mellersta tidsmässiga gyrus, occipital cortex, och överlägsen frontal gyrus; jämfört med att utvärdera circRNA-överflöd över vävnadstyper. Analys av den genererade RNA-SEQ data med hjälp av sex olika circRNA detekterings verktyg (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC, och CIRCexplorer) visade att en icke-återvinningsbara totalt RNA bibliotek förberedelse kit med RNase R pre-behandling och 4 μg RNA-ingång är den optimala metod för att identifiera det högsta relativa antalet circRNAs. I överensstämmelse med tidigare fynd observerades den högsta anrikningen av circRNAs i hjärnvävnader jämfört med andra vävnadstyper.
Introduction
Cirkulär rnas (circrnas) är endogena, icke-kodning rnas som har fått uppmärksamhet med tanke på deras genomträngande uttryck i eukaryota transkriptome1,2,3. De bildas när exonerna back-splice till varandra och därmed ansågs inledningsvis vara splitsning artefakter4,5. Nyligen genomförda studier har dock visat att circrnas uppvisar celltyp, vävnad och utvecklingsstadiet specifikt uttryck3,6 och är evolutionärt bevarad2,3. Dessutom är de inblandade i medling av protein-protein interaktioner7, Micro-RNA (Mirna) bindning3,8,9,10, och reglering av föräldra Gene transkription11.
I klassisk RNA-sekvensering (RNA-SEQ) kan circRNAs helt försvinna under biblioteks konstruktionen till följd av poly-A-val för mRNA eller kan vara svårt att isolera med tanke på deras låga förekomst. De senaste circrna karakteriseringsstudierna har dock införlivat ett steg före behandling med RNase R för att berika circrnas2,12,13. RNase R är en exoribonuclease som smälter linjär rnas, lämnar bakom cirkulära RNA strukturer. CircRNA anrikning protokoll optimerades genom att generera och jämföra data från två kommersiellt tillgängliga hela transkriptome bibliotek byggsatser, med och utan en RNase R före behandling steg, och med varierande mängder av totala RNA-ingång (1 till 4 μg). Det optimerade protokollet användes sedan för att utvärdera förekomsten av circRNAs i fem olika hjärnregioner (cerebellum [BC], sämre parietallob [IP], mellersta tidsmässiga gyrus [MG], occipital cortex [OC] och överlägsen frontal gyrus [SF]) och fyra andra vävnadstyper (lever [LV], lung [LU], lymfkörtel [LN] och bukspottkörteln [PA]). RNA-SEQ-biblioteken var Parade end sekvenserade och data analyserades med hjälp av sex olika algoritmer circrna förutsägelse: find_circ3, Ciri14, mapsplice15, kniv16, DCC17, och circexplorer18. Baserat på vår analys upptäcktes det högsta antalet unika circRNAs vid användning av en icke-återvinningsbara total RNA-biblioteksberedning med RNase R pre-Treatment och 4 μg totalt ingångrna. Det optimerade protokollet beskrivs här. Som tidigare rapporterats19,20observerades den högsta anrikningen av circrnas i hjärnan jämfört med andra vävnadstyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie testades två kommersiellt tillgängliga biblioteks berednings satser, förbehandlings alternativ och indata-RNA-belopp för att optimera ett circRNA anriknings protokoll för byggande av circRNA sekvenserings bibliotek. Baserat på denna studie bedömningar, ett antal viktiga aspekter och kritiska steg för att skapa circRNA sekvensering bibliotek är uppenbara. Vår utvärdering bekräftar nyttan av RNase R pre-behandling, vilket återspeglas av det ökade antalet circRNAs upptäcks. Sammantaget observer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för banner Sun Health Research Institute hjärna och Body donation program (BBDP) i Sun City, Arizona för tillhandahållande av mänskliga hjärnvävnader. BBDP har fått stöd av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke (U24 NS072026 nationella hjärn-och vävnads resurser för Parkinsons sjukdom och relaterade sjukdomar), National Institute on aging (P30AG19610 Arizona Alzheimers sjukdom Core Center), Arizona Department of Health Services (kontrakt 211002, Arizona Alzheimer ‘ s Research Center), Arizona biomedicinska forsknings kommissionen (kontrakt 4001, 0011, 05-901 och 1001 till Arizona Parkinson ‘ s disease Consortium) och Michael J. Fox Foundation för Parkinsons forskning27. Denna studie stöddes också av DHS och delstaten Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). Vi tackar också Andrea Schmitt (banner Research) och Cynthia lechuga (TGen) för administrativt stöd.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al. Scrambled exons. Cell. 64 (3), 607-613 (1991).
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
