Caractérisation des transporteurs de membrane par l'expression hétérologue dans E. coli et la production de vésicules membranaires
Summary
Nous décrivons une méthode pour la caractérisation des transporteurs de membrane proton-conduits dans les préparations de vésicule de membrane produites par l’expression hétérologue dans E. coli et lysis des cellules utilisant une presse Français.
Abstract
Plusieurs méthodes ont été développées pour caractériser fonctionnellement les nouveaux transporteurs de membrane. Les polyamines sont omniprésentes dans tous les organismes, mais les échangeurs de polyamines dans les plantes n’ont pas été identifiés. Ici, nous dénoncons une méthode pour caractériser les antiporteurs de polyamine utilisant des vésicules membranaires générées par la lyse des cellules escherichia coli exprimant hétérolifèrement un antiporteur de plante. Tout d’abord, nous avons exprimé hétérossablement AtBAT1 dans une souche E. coli déficiente dans les transporteurs d’échange de polyamine et d’arginine. Les vésicules ont été produites à l’aide d’une presse Français, purifiée par ultracentrifugation et utilisée dans un procédé de filtration membranaire de substrats étiquetés pour démontrer la spécificité du substrat du transporteur. Ces essais ont démontré qu’AtBAT1 est un transporteur à médiation proton de l’arginine, de l’acide aminobutyrique (GABA), de la putrescine et de la spermidine. La souche mutante qui a été développée pour l’analyse d’AtBAT1 peut être utile pour l’analyse fonctionnelle d’autres familles d’échangeurs de polyamine végétale et animale. Nous émettons également l’hypothèse que cette approche peut être utilisée pour caractériser de nombreux autres types d’antiporteurs, tant que ces protéines peuvent être exprimées dans la membrane cellulaire bactérienne. E. coli est un bon système pour la caractérisation des nouveaux transporteurs, car il existe plusieurs méthodes qui peuvent être utilisées pour mutiler les transporteurs indigènes.
Introduction
Les protéines impliquées dans le trafic de métabolites constituent un niveau essentiel de régulation physiologique, mais la grande majorité des transporteurs de membranes végétales n’ont pas encore été caractérisés fonctionnellement. Plusieurs stratégies ont été mises en œuvre pour caractériser les nouvelles protéines de transport. L’expression hétérologue dans les organismes modèles tels que E. coli et les cellules eucaryotes telles que la levure, les ovocytes Xenopus, les cellules de mammifères, les cellules d’insectes et les cellules végétales ont tous été utilisés pour déterminer leur activité de transport1. Les cellules eucaryotes sont favorisées pour l’expression des protéines eucaryotes, parce que la composition cellulaire de base, les voies de transduire de signal, la transcription et les machines de traduction sont compatibles avec les conditions indigènes.
La levure a été un organisme modèle important pour la caractérisation de nouvelles protéines de transport chez les plantes. La première protéine de transport de plantes qui a été exprimée avec succès dans la levure (Saccharomyces pombe) était le transporteur de hexose HUP1 de Chlorella2. Depuis lors, de nombreuses protéines de transport de plantes ont été fonctionnellement caractérisées à l’aide d’un système d’expression de levure. Il s’agit notamment des transporteurs de sucre végétal (SUC1 et SUC23, VfSUT1 et VfSTP14) et les transporteurs d’auxin (AUX1 et PIN5). Les inconvénients de l’utilisation de levure pour exprimer les protéines végétales peuvent inclure l’activité altérée des protéines plastides localisées parce que la levure manque de cette organelle, mal cibler6, et la formation d’agrégats mal repliés et l’activation des réponses de stress dans la levure en raison de la surexpression des protéines membranaires7,8,9.
L’expression hétérologue des protéines de transport dans les ovocytes Xenopus a été largement utilisée pour la caractérisation électrophysiologique des transporteurs10. Les premières protéines de transport de plantes caractérisées à l’aide d’une expression hétérologue dans les ovocytes Xenopus étaient le canal de potassium D’Arabidopsis KAT110 et le transporteur d’hexose Arabidopsis STP111. Depuis lors, les ovocytes Xenopus ont été utilisés pour caractériser de nombreuses protéines de transport de plantes telles que les transporteurs de membrane splamine12, transporteur de saccharose vacuolaire SUT413 et transporteur de malate vacuolaire ALMT914. Une limitation importante des ovocytes Xenopus pour les essais de transport est que la concentration de métabolites intracellulaires ne peut pas être manipulée1. En outre, des connaissances professionnelles sont nécessaires pour préparer les ovocytes Xenopus et la variabilité des lots d’ovocytes est difficile à contrôler.
L’expression hétérologue dans l’organisme modèle E. coli est un système idéal en termes de caractérisation des nouvelles protéines de transport des plantes. Avec un génome entièrement séquencé15, les caractéristiques moléculaires et physiologiques d’E. coli sont bien connues. Les outils et les techniques moléculaires sont bien établis16. En outre, différents vecteurs d’expression, souches non pathogènes et mutants sont disponibles17,18,19. En outre, E. coli a un taux de croissance élevé et peut être facilement cultivé dans des conditions de laboratoire. De nombreuses protéines peuvent être facilement exprimées et purifiées en grandes quantités dans E. coli9. Lorsque les protéines ne peuvent pas être astorquées directement dans les systèmes cellulaires, la reconstitution des protéines en liposomes a également été une innovation réussie, bien que difficile pour la caractérisation des protéines membranaires purifiées. La caractérisation fonctionnelle des protéines de transport mitochondrial des plantes, y compris les transporteurs de solutés tels que les transporteurs de phosphate dans le soja, le maïs, le riz et l’arabidopsis, le transporteur de dicarboxylate-tricarboxylate dans Arabidopsis ont été accomplies en utilisant ce système modèle20,21. Cependant, les protéines recombinantes de la protéine de tomate SICAT9 se sont avérées non fonctionnelles dans les expériences de reconstitution, et d’autres membres de la famille de transporteur de CAT se sont avérés non fonctionnels dans Xenopus oocyte s’indique22. Ainsi, des outils moléculaires supplémentaires sont nécessaires pour la caractérisation des transporteurs de membranes.
Cinq systèmes de transport de polyamine se trouvent dans E. coli23. Il s’agit de deux transporteurs ABC médiateurs de l’apport de spermidine et de putrescine, d’un échangeur de putrescine/ornithine, d’un échangeur de cadaverine/lysine, d’un exportateur de spermidine et d’un importateur de putrescine. L’échangeur de putrescine PotE a été caractérisé à l’origine à l’aide d’un étosay vésicule, où l’intérieur des vésicules ont été préparés en lysing cellules avec une presse Français et de mesurer l’utilisation de putrescine radiolabeled dans les vésicules en échange de l’ornithine24. Des essais de vésicule ont également été utilisés pour caractériser un transporteur de calcium, qui a négocié le transport du calcium en réponse à un gradient de proton25. Ces expériences nous ont incités à développer une stratégie pour la caractérisation d’autres échangeurs de polyamines. Nous avons d’abord créé une souche de E. coli déficiente chez les échangeurs de PotE et de CadB. Ici, nous démontrons la caractérisation fonctionnelle d’un antiporteur de polyamine de plante par l’expression hétérologue dans la souche modifiée d’E. coli, la génération des vésicules de membrane utilisant une presse Français, et les essais radiolabeled.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans la présente étude, nous dénoncions une méthode pour la caractérisation d’un antiporteur en exprimant d’abord la protéine dans E. coli, puis en générant des vésicules membranaires, de sorte que la protéine hétérogène peut être astoyée dans un système sans cellules. En plus de l’équipement trouvé dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire, cette stratégie nécessite l’utilisation d’une presse Français, d’un ultracentrifuge et de l’accès à une installation pour effectuer de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le BGSU Graduate College et le BGSU Office of Sponsored Programs and Research ont appuyé ce projet.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3H-putrescine | PerkinElmer | NET185001MC | |
| 3H-spermidine | PerkinElmer | NET522001MC | |
| 4-chloro-1-naphthol | Sigma-Aldrich | C8890 | |
| 14C arginine | Moravek Inc. | MC137 | |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A-5006 | |
| Anti-His (C-term)-HRP antibody | ThermoFisher | R931-25 | Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher | 23227 | Pierce BCA protein asay kit. |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 161-0404 | |
| Carboxypeptidase B | Sigma-Aldrich | C9584-1mg | |
| Centrifuge | Sorvall | SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor | |
| Dounce tissue grinder | LabGenome | 7777-7 | Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout. |
| Ecoscint-H | National Diagnostics | LS275 | scintillation cocktail |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Filtration manifold | Hoefer | FH225V | |
| French Pressure Cell | Glen Mills | FA-080A120 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G6904 | |
| Glycerol | |||
| GraphPad Prism software | http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm | ||
| Hydrogen peroxide | KROGER | ||
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Liquid scintillation counter | Beckman | LS-6500 | |
| Maleate | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ||
| Nitrocellulose membrane filters | Merck Millipore | hawp02500 | 0.45 µM |
| PCR clean up kit | Genscript | QuickClean II | |
| Potassium Phosphate dibasic | ThermoFisher | P290-500 | |
| putrescine | fluka | 32810 | |
| Potassium Phosphate monobasic | J.T.Baker | 4008 | |
| Spermidine | Sigma-aldrich | S2501 | |
| Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 | This manuscript | Available upon request. | Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers. |
| Tris-base | Research Products | T60040-1000 | |
| Ultracentrifuge | Sorvall MTX 150 | 46960 | Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor |
| Ultracentrifuge tubes | ThermoFisher | 45237 | Centrifuge tubes for S150-AT rotor |
| Vector: pBAD-DEST49 | ThermoFisher | Gateway expression vector for E. coli |
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