Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane
Summary
Descriviamo un metodo per la caratterizzazione dei trasportatori a membrana protonica in preparati a vescicolo a membrana prodotti dall’espressione etesologa in E. coli e lisi di cellule che utilizzano una pressa francese.
Abstract
Sono stati sviluppati diversi metodi per caratterizzare funzionalmente nuovi trasportatori a membrana. Le poliamine sono onnipresenti in tutti gli organismi, ma gli scambiatori di poliamina nelle piante non sono stati identificati. Qui, dedichiamo un metodo per caratterizzare gli antiportatori di poliammina utilizzando vesciche di membrana generate dalla lisi delle cellule di Escherichia coli eterologicamente esprimendo un antiportatore vegetale. In primo luogo, abbiamo espresso etelogusly AtBAT1 in un ceppo E. coli carente in poliamina e trasportatori di scambio di arginina. Le vesciche sono state prodotte utilizzando una pressa francese, purificata dall’ultracentrifugazione e utilizzata in un saggio di filtrazione a membrana di substrati etichettati per dimostrare la specificità del substrato del trasportatore. Questi saggi hanno dimostrato che AtBAT1 è un trasportatore mediato da protoni di arginina, acido z-aminobutyrico (GABA), putrescina e spermide. Il ceppo mutante sviluppato per il saggio di AtBAT1 può essere utile per l’analisi funzionale di altre famiglie di scambiatori di poliammina vegetale e animale. Ipotizziamo anche che questo approccio possa essere utilizzato per caratterizzare molti altri tipi di antiportatori, purché queste proteine possano essere espresse nella membrana cellulare batterica. E. coli è un buon sistema per la caratterizzazione di nuovi trasportatori, dal momento che ci sono diversi metodi che possono essere impiegati per mutagenizzare i trasportatori nativi.
Introduction
Le proteine coinvolte nel traffico di metaboliti costituiscono un livello essenziale di regolazione fisiologica, ma la stragrande maggioranza dei trasportatori di membrana vegetale non è ancora stata caratterizzata funzionalmente. Sono state implementate diverse strategie per caratterizzare nuove proteine da trasporto. Espressione etetologa in organismi modello come E. coli e cellule eucariotiche come lievito, Enopus oocyte, cellule di mammiferi, cellule di insetti e cellule vegetali sono stati tutti utilizzati per determinare la loro attività di trasporto1. Le cellule eucariotiche sono favorite per l’espressione di proteine eucariotiche, perché la composizione cellulare di base, i percorsi transducivi del segnale, la trascrizione e la traduzione di macchine automatiche sono compatibili con le condizioni native.
Il lievito è stato un importante organismo modello per la caratterizzazione di nuove proteine di trasporto nelle piante. La prima proteina per il trasporto vegetale che è stata espressa con successo nel lievito (Saccharomyces pombe) è stata il trasportatore esososo HUP1 da Chlorella2. Da allora, molte proteine del trasporto vegetale sono state caratterizzate funzionalmente utilizzando un sistema di espressione del lievito. Questi includono, trasportatori di zucchero vegetale (SUC1 e SUC23, VfSUT1 e VfSTP14) e i trasportatori di auxina (AUX1 e PIN5). Svantaggi di utilizzare il lievito per esprimere le proteine vegetali possono includere l’attività alterata delle proteine plastidi-localizzate perché il lievito manca di questo organello, mistargeting6, e la formazione di aggregati piegati male e l’attivazione delle risposte allo stress nel lievito a causa della sovraespressione delle proteine della membrana7,8,9.
L’espressione etetologa delle proteine da trasporto negli evociti Xenopus è stata ampiamente utilizzata per la caratterizzazione elettrofisiologica dei trasportatori10. Le prime proteine del trasporto vegetale caratterizzate dall’espressione eteologa negli ovociti di Xenopus sono state il canale di potassio arabidopsis KAT110 e il trasportatore esaso dell’Arabidopsis STP111. Da allora, gli evociti Xenopus sono stati impiegati per caratterizzare molte proteine del trasporto vegetale come trasportatori di membrana plasmatica12, trasportatore di saccarosio vacuolare SUT413 e trasportatore vacuolar malate ALMT914. Un’importante limitazione degli evociti Xenopus per i saggi di trasporto è che la concentrazione di metaboliti intracellulari non può essere manipolata1. Inoltre, le conoscenze professionali sono necessarie per preparare gli evociti Xenopus e la variabilità dei lotti di ovociti è difficile da controllare.
L’espressione eterologa nell’organismo modello E. coli è un sistema ideale in termini di caratterizzazione di nuove proteine di trasporto vegetale. Con un genoma completamente sequenziato15, le caratteristiche molecolari e fisiologiche di E. coli sono ben note. Gli strumenti e le tecniche molecolari sono ben definiti16. Inoltre, diversi vettori di espressione, ceppi non patogeni e mutanti sono disponibili17,18,19. Inoltre, E. coli ha un alto tasso di crescita e può essere facilmente coltivato in condizioni di laboratorio. Molte proteine possono essere facilmente espresse e purificate a elevate quantità in E. coli9. Quando le proteine non possono essere analisi direttamente nei sistemi cellulari, la ricostituzione delle proteine in liposomi è stata anche un’innovazione di successo, anche se impegnativa, per la caratterizzazione delle proteine della membrana purificate. Caratterizzazione funzionale delle proteine di trasporto mitocondriali vegetali tra cui trasportatori soluti come trasportatori di fosfati in soia, mais, riso e arabidopsis, vettore dicarboxylate-tricarboxylate in Arabidopsis sono stati realizzati utilizzando questo sistema modello20,21. Tuttavia, le proteine ricombinanti della proteina pomodoro SICAT9 sono risultate non funzionali negli esperimenti di ricostituzione, e altri membri della famiglia dei trasportatori CAT sono stati trovati non funzionali nei saggi di Xenopus oocyte22. Pertanto, sono necessari ulteriori strumenti molecolari per la caratterizzazione dei trasportatori di membrana.
Cinque sistemi di trasporto della poliammina si trovano in E. coli23. Essi comprendono due trasportatori ABC che mediano l’assorbimento di spermidina e putrescina, uno scambiatore putrescina/ornitina, uno scambiatore di cadaverina/lisina, un esportatore di spermidine e un importatore di putrescina. Lo scambiatore putrescine PotE è stato originariamente caratterizzato utilizzando un saggio vescino, dove vescicoli all’interno verso l’esterno sono stati preparati da cellule liscicon con una pressa francese e misurando l’assorbimento di putrescina radioetichettata nelle vesciche in cambio di ornina24. I saggi vescicoli sono stati utilizzati anche per caratterizzare un trasportatore di calcio, che mediava il trasporto di calcio in risposta a un gradiente protonico25. Questi esperimenti ci hanno spinto a sviluppare una strategia per la caratterizzazione di altri scambiatori di poliamina. Per prima cosa abbiamo creato un ceppo di Scambiatori Di E. coli carenti in Scambiatori PotE e CadB. Qui, dimostriamo la caratterizzazione funzionale di un antiportatore di poliammina vegetale per espressione eteloga nel ceppo E. coli modificato, generazione di vesciche a membrana utilizzando una pressa francese e saggi radioetichettati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel presente studio, illustreremo un metodo per la caratterizzazione di un antiportatore esprimendo prima la proteina in E. coli e poi generando vescicle a membrana, in modo che la proteina eterologamente espressa possa essere presentata in un sistema privo di cellule. Oltre alle attrezzature presenti nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare, questa strategia richiede l’uso di una stampa francese, un ultracentrifuga e l’accesso a una struttura per condurre saggi radioisotopi.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno a questo progetto è stato fornito dal BGSU Graduate College e dall’Ufficio BGSU dei programmi sponsorizzati e della ricerca.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3H-putrescine | PerkinElmer | NET185001MC | |
| 3H-spermidine | PerkinElmer | NET522001MC | |
| 4-chloro-1-naphthol | Sigma-Aldrich | C8890 | |
| 14C arginine | Moravek Inc. | MC137 | |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A-5006 | |
| Anti-His (C-term)-HRP antibody | ThermoFisher | R931-25 | Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher | 23227 | Pierce BCA protein asay kit. |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 161-0404 | |
| Carboxypeptidase B | Sigma-Aldrich | C9584-1mg | |
| Centrifuge | Sorvall | SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor | |
| Dounce tissue grinder | LabGenome | 7777-7 | Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout. |
| Ecoscint-H | National Diagnostics | LS275 | scintillation cocktail |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Filtration manifold | Hoefer | FH225V | |
| French Pressure Cell | Glen Mills | FA-080A120 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G6904 | |
| Glycerol | |||
| GraphPad Prism software | http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm | ||
| Hydrogen peroxide | KROGER | ||
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Liquid scintillation counter | Beckman | LS-6500 | |
| Maleate | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ||
| Nitrocellulose membrane filters | Merck Millipore | hawp02500 | 0.45 µM |
| PCR clean up kit | Genscript | QuickClean II | |
| Potassium Phosphate dibasic | ThermoFisher | P290-500 | |
| putrescine | fluka | 32810 | |
| Potassium Phosphate monobasic | J.T.Baker | 4008 | |
| Spermidine | Sigma-aldrich | S2501 | |
| Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 | This manuscript | Available upon request. | Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers. |
| Tris-base | Research Products | T60040-1000 | |
| Ultracentrifuge | Sorvall MTX 150 | 46960 | Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor |
| Ultracentrifuge tubes | ThermoFisher | 45237 | Centrifuge tubes for S150-AT rotor |
| Vector: pBAD-DEST49 | ThermoFisher | Gateway expression vector for E. coli |
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