Karakterisering av membran transportører av Heterologous uttrykk i E. coli og produksjon av membran blemmer

Summary

Vi beskriver en metode for karakterisering av Proton-drevet membran transportører i membran vesicle preparater produsert av heterologous uttrykk i E. coli og lyse av celler ved hjelp av en fransk trykk.

Abstract

Flere metoder har blitt utviklet for å funksjonelt karakterisere romanen membran transportører. Polyaminer er allestedsnærværende i alle organismer, men polyamin vekslere i planter har ikke blitt identifisert. Her skisserer vi en metode for å karakterisere polyamin antiporters ved hjelp av membran blemmer generert fra lyse av Escherichia coli celler heterologously uttrykker en plante antiporter. Først, vi heterologously uttrykt AtBAT1 i en E. coli stamme mangelfull i polyamin og arginin utveksling transportører. Blemmer ble produsert ved hjelp av en fransk trykk, renset ved ultracentrifugation og benyttes i en membran filtrering analysen av merket underlag for å demonstrere underlaget spesifisitet av transportøren. Disse analysene viste at AtBAT1 er et proton-mediert transportør av arginine, γ-aminobutyric acid (GABA), putresin og spermidin. Den muterte belastningen som ble utviklet for analysen av AtBAT1 kan være nyttig for funksjonell analyse av andre familier av planter og dyr polyamin vekslere. Vi hypothesize også at denne tilnærmingen kan brukes til å karakterisere mange andre typer antiporters, så lenge disse proteinene kan uttrykkes i bakterie cellemembranen. E. coli er et godt system for karakterisering av romanen transportører, siden det er flere metoder som kan anvendes for å mutagenize innfødte transportører.

Introduction

Proteiner som er involvert i smugling av metabolitter utgjør et viktig nivå av fysiologisk regulering, men det store flertallet av plante membran transportører har ennå ikke vært funksjonelt karakterisert. Flere strategier har blitt iverksatt for å karakterisere romanen transport proteiner. Heterologous uttrykk i modell organismer som E. coli og eukaryote celler som gjær, Xenopus oocytter, pattedyrceller, insekt celler og planteceller har alle blitt brukt til å bestemme deres transport aktivitet¹. Eukaryote celler er foretrukket for uttrykk for eukaryote proteiner, fordi den grunnleggende cellulære sammensetning, signal transducing trasé, transkripsjon og oversettelse machineries er kompatible med de innfødte forhold.

Gjær har vært en viktig modell organisme for karakterisering av romanen transport proteiner i planter. Den første planten transport protein som var vellykket uttrykt i gjær (Saccharomyces pombe) var HEXOSE transporter HUP1 fra chlorella². Siden da har mange plante transport proteiner vært funksjonelt karakterisert ved hjelp av en gjær uttrykks system. Disse inkluderer, plante sukker transportører (SUC1 og SUC2³, VfSUT1 og VfSTP1⁴) og auxin TRANSPORTØRER (AUX1 og PIN⁵). Ulemper ved å utnytte gjær å uttrykke planteproteiner kan inkludere nedsatt aktivitet av plastid-lokaliserte proteiner fordi gjær mangler denne organelle, mistargeting⁶, og dannelse av misfolded aggregater og aktivering av stressresponser i gjær på grunn av overuttrykte av membran proteiner^7,8,9.

Heterologous uttrykk for transport proteiner i Xenopus oocytter har vært mye brukt for elektrofysiologisk karakterisering av transportører¹⁰. Den første planten transport proteiner karakterisert ved hjelp heterologous uttrykk i Xenopus oocytter var Arabidopsis KALIUM kanalen KAT1¹⁰ og Arabidopsis hexose transporter STP1¹¹. Siden da har Xenopus oocytter vært ansatt for å karakterisere mange plante transport proteiner som plasma membran transportører¹², vacuolar sukrose transporter SUT4¹³ og vacuolar Malate transporter ALMT9¹⁴. En viktig begrensning av Xenopus oocytter for transport analyser er at konsentrasjonen av intracellulære metabolitter ikke kan manipuleres¹. Videre er faglig kunnskap som kreves for å forberede Xenopus oocytter og variasjonen av oocyte partier er vanskelig å kontrollere.

Heterologous uttrykk i modellen organisme E. coli er et ideelt system i form av karakterisering av romanen plante transport proteiner. Med en fullt sekvensert Genova¹⁵, de molekylære og fysiologiske egenskapene til E. coli er godt kjent. Molekylær verktøy og teknikker er godt etablert¹⁶. I tillegg er ulike uttrykk vektorer, ikke-patogene stammer og mutanter tilgjengelig^17,18,19. Videre har E. coli en høy vekst og kan lett dyrkes under laboratorieforhold. Mange proteiner kan lett uttrykkes og renses ved høye beløp i E. coli⁹. Når proteiner ikke kan analyseres direkte i cellulære systemer, har rekonstituering av proteiner til liposomer også vært en suksess, om enn utfordrende innovasjon for karakterisering av renset membran proteiner. Funksjonell karakterisering av anlegget mitokondrie transport proteiner inkludert stoff transportører som fosfat transportører i soyabønner, mais, ris og Arabidopsis, dicarboxylate-tricarboxylate carrier in Arabidopsis har blitt gjort ved hjelp av denne modellen systemet^20,21. Men rekombinant proteiner av tomat protein SICAT9 ble funnet å være fungerende i rekonstituering eksperimenter, og andre medlemmer av CAT transporter familien ble funnet å være fungerende i Xenopus oocyte analyser²². Dermed er flere molekylære verktøy er nødvendig for karakterisering av membran transportører.

Fem polyamin transportsystemer finnes i E. coli²³. De omfatter to ABC transportører formidling opptaket av spermidin og putresin, en putresin/Ornithine veksler, en kadaverin/lysin veksler, en spermidin eksportør og en putresin importør. Den putresin veksler PotE ble opprinnelig karakterisert ved hjelp av en vesicle analysen, der innsiden ut blemmer ble utarbeidet av lysering celler med en fransk Trykk og måle opptaket av radiolabeled putresin inn i blemmer i bytte for Ornithine²⁴. Vesicle analyser ble også brukt til å karakterisere en kalsium transportør, som mediert transport av kalsium som svar på et proton gradient²⁵. Disse eksperimentene bedt oss om å utvikle en strategi for karakterisering av andre polyamin vekslere. Vi først opprettet en stamme av E. coli mangelfull i PotE og CadB vekslere. Her viser vi funksjonell karakterisering av en plante polyamin antiporter ved heterlogous uttrykk i den modifiserte E. coli stamme, generering av membran blemmer ved hjelp av en fransk trykk, og radiolabeled analyser.

Protocol

1. generering av E. coli Double Knock Out mutant med P1 Transduction Få E. coli single-knockout mutant stammer ΔPotE og ΔCadB fra E. coli genetiske Stock Center (http://cgsc.Biology.Yale.edu).Merk: Den ΔPotE stammen er kanamycin motstandsdyktig26 og ΔCadB belastningen er Tetracycline motstandsdyktig27. Konstr…

Representative Results

De viktigste trinnene i denne protokollen er oppsummert pictorially i figur 1. Kort, E. coli celler mangelfull i alle polyamin vekslere og uttrykker AtBAT1 er kultivert, sentrifugert, vasket med en buffer og utsatt for cellelyse med en fransk trykk. Lyse har en tendens til å produsere blemmer som er stort sett inne-ut og felle buffer utenfor cellene. Celle rusk er fjernet av sentrifugering, og en andre ultracentifugation trinn brukes til å…

Discussion

I denne studien skisserer vi en metode for karakterisering av en antiporter ved først å uttrykke proteinet i E. coli og deretter generere membran blemmer, slik at heterologously-uttrykt protein kan analyseres i en celle-fri system. I tillegg til utstyr som finnes i de fleste molekylære biologi laboratorier, krever denne strategien bruk av en fransk presse, en ultracentrifuge, og tilgang til et anlegg for å gjennomføre radioisotop analyser.

En grunnleggende forutsetning for denne …

Materials

2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
3H-putrescine	PerkinElmer	NET185001MC
3H-spermidine	PerkinElmer	NET522001MC
4-chloro-1-naphthol	Sigma-Aldrich	C8890
14C arginine	Moravek Inc.	MC137
Arginine	Sigma-Aldrich	A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody	ThermoFisher	R931-25	Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
BCA protein assay kit	ThermoFisher	23227	Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue	Bio-Rad	161-0404
Carboxypeptidase B	Sigma-Aldrich	C9584-1mg
Centrifuge	Sorvall		SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder	LabGenome	7777-7	Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	scintillation cocktail
EDTA	Sigma-Aldrich
Filtration manifold	Hoefer	FH225V
French Pressure Cell	Glen Mills	FA-080A120
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Glutamate	Sigma-Aldrich	G6904
Glycerol
GraphPad Prism software			http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide	KROGER
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Liquid scintillation counter	Beckman	LS-6500
Maleate	Sigma-Aldrich	M0375
Nanodrop	ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters	Merck Millipore	hawp02500	0.45 µM
PCR clean up kit	Genscript		QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic	ThermoFisher	P290-500
putrescine	fluka	32810
Potassium Phosphate monobasic	J.T.Baker	4008
Spermidine	Sigma-aldrich	S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10	This manuscript	Available upon request.	Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base	Research Products	T60040-1000
Ultracentrifuge	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes	ThermoFisher	45237	Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49	ThermoFisher		Gateway expression vector for E. coli