Aislamiento de subconjuntos de macrófagos y células estromas de especímenes miocárgonos humanos y de ratón
Summary
Aquí se presenta un protocolo para aislar varios subconjuntos de macrófagos y otras células no inmunes del miocardio humano y de ratón mediante la preparación de una suspensión de una sola célula a través de la digestión enzimática. También se presentan esquemas de gating para la identificación basada en citometría de flujo y la caracterización de macrófagos aislados.
Abstract
Los macrófagos representan las poblaciones de células inmunitarias más heterogéneas y abundantes del corazón y son fundamentales para impulsar la inflamación y las respuestas reparadoras después de una lesión cardíaca. Cómo varios subconjuntos de macrófagos orquestan las respuestas inmunitarias después de una lesión cardíaca es un área activa de investigación. Aquí se presenta un protocolo simple que nuestro laboratorio realiza de forma rutinaria, para la extracción de macrófagos de muestras de ratón y miocardio humano obtenidas de individuos sanos y enfermos. Brevemente, este protocolo implica la digestión enzimática del tejido cardíaco para generar una suspensión de una sola célula, seguida de la tinción de anticuerpos, y la citometría de flujo. Esta técnica es adecuada para ensayos funcionales realizados en células clasificadas, así como secuenciación de ARN a granel y de una sola célula. Una de las principales ventajas de este protocolo es su simplicidad, mínima variación diaria y amplia aplicabilidad que permite investigar la heterogeneidad de los macrófagos en varios modelos de ratón y entidades de enfermedades humanas.
Introduction
Los macrófagos representan el tipo de células inmunitarias más abundante en el corazón, y desempeñan un papel importante en la generación de respuestas inflamatorias y reparativas robustas después de una lesión cardíaca1,2,3,4. Anteriormente, nuestro grupo identificaba dos subconjuntos principales de macrófagos en el corazón murino derivados de orígenes de desarrollo distintos5,6. En términos generales, se pueden identificar poblaciones distintas de subconjuntos de macrófagos cardíacos residentes en tejidos en función de la expresión de la superficie celular de CCR2 (receptor de quimioquina con motivo C-C 2). CCR2– los macrófagos (expresión de la superficie celular: CCR2–MHCIIlow y CCR2–MHCIIhigh)son de origen embrionario (linajes primitivos y eritromieloides), capaces de autorenovarse y representar a una población dominante en condiciones homeostáticas. Los macrófagos residentes CCR2+ son de origen hematopoyético definitivo, se mantienen a través del reclutamiento de monocitos circulantes y representan a una población menor en condiciones homeostáticas. Funcionalmente, CCR2– los macrófagos generan una inflamación mínima y son críticos para el desarrollo coronario de regeneración cardíaca neonatal5,7. Por el contrario, CCR2+ macrófagos inician respuestas inflamatorias robustas después de insultos cardíacos y contribuyen a la lesión colateral de cardiomiocitos, la remodelación adversa del ventrículo izquierdo, y la progresión de la insuficiencia cardíaca8,9.
Recientemente, hemos demostrado que el miocardio humano también contiene dos subconjuntos distintos de macrófagos identificados de manera similar como CCR2– o CCR2+8. La expresión génica y los análisis funcionales revelaron que los macrófagos ccr2humanos – y CCR2+ representan subconjuntos funcionalmente divergentes y son funcionalmente análogos a CCR2– y los macrófagos CCR2+ que se encuentran en el corazón del ratón. CCR2 humano– los macrófagos expresan niveles robustos de factores de crecimiento, incluyendo IGF1, PDGF, Cyr61, y HB-EGF. CCR2+ macrófagos se enriquecen en quimioquinas y citoquinas que promueven la inflamación, como IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7, y TNF-a. Los macrófagos estimulados CCR2+ macrófagos secretan niveles notablemente más altos de la interleucina de citoquina inflamatoria-1o (IL-1o) en cultivo. La forma en que estos subconjuntos contribuyen diferencialmente a la reparación de tejidos y a la remodelación del ventular izquierdo (LV) en el contexto de una lesión cardíaca sigue siendo un área de investigación activa.
El análisis basado en citometría de flujo de la heterogeneidad de macrófagos en el ratón y el corazón humano requiere digerir el tejido cardíaco y generar una suspensión de una sola célula seguida de un análisis citométrico de flujo o clasificación celular para otros procesos aguas abajo, como la secuenciación masiva de ARN/secuenciación de ARN de una sola célula o el cultivo de las células para ensayos funcionales. El protocolo original para hacer una suspensión de una sola célula de corazones murinos fue reportado por primera vez por el grupo Nahrendorf en Nahrendorf et al. 200710. Nuestro laboratorio ha adaptado y modificado el protocolo para extraer macrófagos del miocardio humano. Usando el mismo protocolo pero con ligera modificación en el esquema de tinción y gating, CD45– células estromales del miocardio humano también se pueden cosechar. Aquí se presenta, en texto y vídeo, un protocolo que se realiza rutinariamente para la extracción de macrófagos o estromatos del miocardio humano.
Las muestras de tejido cardíaco se obtienen de pacientes adultos con cardiomiopatía dilatada (DCM: idiopática o familiar) o cardiomiopatía isquémica (MIC) sometidos a implantación de dispositivode asistencia ventricular izquierda (LVAD) o trasplante cardíaco. Los corazones explantados o los núcleos LVAD se perfunden intravascularmente con salina fría antes de iniciar el procedimiento de digestión. Es importante tener en cuenta que la “calidad” de la muestra de tejido determinada en términos de grado de cicatrización o infiltración de tejido adiposo puede afectar en gran medida el rendimiento de los macrófagos. Los especímenes cardíacos con grandes áreas de cicatrización tendrán un rendimiento celular mucho menor y pueden plantear una limitación técnica grave cuando los métodos de análisis aguas abajo deseados requieren el cultivo celular in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo permite la extracción de varios subconjuntos de macrófagos del miocardio humano. El protocolo es simple y tarda de 3 a 4 horas en preparar la suspensión de una sola célula lista para el análisis facS. Aunque el protocolo es relativamente fácil de realizar, hay ciertos aspectos técnicos que deben ser considerados que minimizarán la variabilidad. En primer lugar, trabajar de manera oportuna con tejido humano es necesario para una óptima viabilidad celular. Es importante mantener el tejido en salina fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue posible gracias a la financiación del Children’s Discovery Institute de la Universidad de Washington y del St. Louis Children’s Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), la Fundación del Hospital Judío Barnes (8038-88) y la NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. cuenta con el apoyo de NIH K08 HL123519 y Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
