Summary

Isolamento di sottoinsiemi di macrofaschi e cellule stromali da esemplari di miocardio umano e topo

Published: December 17, 2019
doi:

Summary

Presentato qui è un protocollo per isolare vari sottoinsiemi di macrofagi e altre cellule non immuni dal miocardio umano e topidano preparando una sospensione a singola cellula attraverso la digestione enzimatica. Vengono inoltre presentati schemi di Gating per l’identificazione e la caratterizzazione basata sulla citometria del flusso di macrofagi.

Abstract

I macrofagi rappresentano le popolazioni di cellule immunitarie più eterogenee e abbondanti nel cuore e sono centrali nel guidare l’infiammazione e le risposte riparative dopo lesioni cardiache. Come vari sottoinsiemi di macrofagi orchestrano le risposte immunitarie dopo lesioni cardiache è un’area attiva di ricerca. Presentato qui è un semplice protocollo che il nostro laboratorio esegue regolarmente, per l’estrazione di macrofagi da campioni di topo e miocardio umano ottenuti da individui sani e malati. In breve, questo protocollo comporta la digestione enzimatica del tessuto cardiaco per generare una singola sospensione cellulare, seguita da colorazione anticorpale, e citometria di flusso. Questa tecnica è adatta per i saggi funzionali eseguiti su cellule ordinate e per il sequenziamento di RNA sfuso e a singola cellula. Uno dei principali vantaggi di questo protocollo è la sua semplicità, la variazione minima giorno per giorno e l’ampia applicabilità che consente lo studio dell’eterogeneità dei macrofaci tra vari modelli murini ed entità di malattie umane.

Introduction

I macrofagi rappresentano il tipo di cellule immunitarie più abbondanti nel cuore, e svolgono un ruolo significativo nel generare robuste risposte infiammatorie e riparative dopo lesioni cardiache1,2,3,4. In precedenza, il nostro gruppo identificava due sottoinsiemi principali di macrofagi nel cuore murino derivati da origini dello sviluppo distinte5,6. In generale, è possibile identificare popolazioni distinte di sottoinsiemi di macrofagi cardiaci residenti in tessuto in base all’espressione della superficie cellulare del CCR2 (recettore chemiochina motivo C-C 2). CCR2 i macrofagi (espressione della superficie cellulare: CCR2MHCIIbasso e CCR2MHCIIalto)sono di origine embrionale (linee primitive ed eritromieloidi), in grado di auto-rinnovarsi e rappresentare una popolazione dominante in condizioni omeostatiche. Residenti CCR2 i macrofagi sono di origine ematopoietica definitiva, sono mantenuti attraverso il reclutamento di monociti circolanti e rappresentano una popolazione minore in condizioni omeostatiche. Funzionalmente, CCR2– i macrofagi generano un’infiammazione minima e sono fondamentali per lo sviluppo coronarica cardiaca neonatale5,7. Al contrario, i macrofagi CCR2 avviano robuste risposte infiammatorie a seguito di insulti cardiaci e contribuiscono a lesioni cardiomiociti collaterali, rimodellamento avverso del ventricolo sinistro e progressione dell’insufficienza cardiaca8,9.

Recentemente, abbiamo dimostrato che il miocardio umano contiene anche due distinti sottoinsiemi di macrofagi identificati in modo simile a CCR2 o CCR28. L’espressione genica e le analisi funzionali hanno rivelato che i macrofagi CCR2 e CCR2 rappresentano sottoinsiemi funzionalmente divergenti e sono funzionalmente analoghi a CCR2 e CCR2 macrofagi trovati nel cuore del topo. Human CCR2 i macrofagi esprimono solidi livelli di fattori di crescita, tra cui IGF1, PDGF, Cyr61 e HB-EGF. I macrofagi CCR2sono arricchiti in chemiochini e citochine che promuovono l’infiammazione, come IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 e TNF-a. I macrofagi stimolati secernono livelli marcatamente più elevati della citochina infiammatoria interleuchina-1 ( IL-1) in coltura. Il modo in cui questi sottoinsiemi contribuiscono in modo differenziale alla riparazione dei tessuti e al rimodellamento ventricolare sinistro (LV) nel contesto delle lesioni cardiache rimane un’area di ricerca attiva.

L’analisi basata sulla citometria del flusso nel mouse e nel cuore umano richiede la digestione del tessuto cardiaco e la generazione di una sospensione a singola cellula seguita dall’analisi citometrica del flusso o dallo smistamento cellulare per ulteriori processi a valle come il sequenziamento di massa di RNA /sequenziamento dell’RNA a singola cellula o la coltura delle cellule per analisi funzionali. Il protocollo originale per la creazione di una sospensione a cella singola da cuori murini è stato riportato per la prima volta dal gruppo Nahrendorf in Nahrendorf et al. 200710. Il nostro laboratorio ha adattato e modificato il protocollo per estrarre i macrofagi dal miocardio umano. Utilizzando lo stesso protocollo, ma con una leggera modifica nello schema di colorazione e gating, CD45 cellule stromali del miocardio umano può anche essere raccolto. Presentato qui, in testo e video, è un protocollo che viene eseguito regolarmente per l’estrazione di macrofagi o stromal dal miocardio umano.

I campioni di tessuto cardiaco sono ottenuti da pazienti adulti con cardiomiopatia dilatata (DCM: idiopatica o familiare) o cardiomiopatia ischemica (ICM) sottoposta a impianto di assistenza ventricolare sinistra (LVAD) impianto o trapianto cardiaco. I cuori esoppiantati o i nuclei LVAD sono intravascolari perfusi con salina fredda prima di iniziare la procedura di digestione. È importante notare che la “qualità” del campione di tessuto determinata in termini di grado di cicatrici o infiltrazione di tessuto adiposo può influenzare notevolmente la resa dei macrofagi. Gli esemplari cardiaci con ampie aree di cicatrici avranno una resa cellulare molto più bassa e possono porre gravi limitazioni tecniche quando i metodi di analisi a valle desiderati richiedono una coltura cellulare in vitro.

Protocol

Il protocollo presentato è stato approvato dalla Washington University nel St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Tutti i soggetti forniscono il consenso informato prima della raccolta dei campioni e gli esperimenti vengono eseguiti in conformità con il protocollo di studio approvato. Il protocollo presentato viene eseguito con l’approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della Washington University School of Medicine e segue le linee guida descritte nella Guida NIH per la cur…

Representative Results

Il protocollo descritto consente l’isolamento dei macrofagi dal topo e dal miocardio umano. Utilizzando lo stesso protocollo, ma con una diversa strategia di colorazione e gating, le cellule stromali possono anche essere raccolte dal miocardio umano. I risultati FACS qui presentati sono stati acquisiti sulla piattaforma BD LSRII o BD FACS ARIA III. I controlli di compensazione sono stati generati da campioni di controllo del colore singolo provenienti da splenociti macchiati. <strong clas…

Discussion

Il protocollo consente l’estrazione di vari sottoinsiemi di macrofafi dal miocardio umano. Il protocollo è semplice e richiede da 3 a 4 ore per preparare le sospensioni a cella singola pronte per l’analisi FACS. Anche se il protocollo è relativamente semplice da eseguire, ci sono alcuni aspetti tecnici che devono essere considerati che ridurrà al minimo la variabilità. In primo luogo, lavorare in modo tempestivo con il tessuto umano è necessario per una vitalità cellulare ottimale. È importante mantenere il tessut…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto è stato reso possibile dai finanziamenti forniti dal Children’s Discovery Institute della Washington University e dal St. Louis Children’s Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), dalla Fondazione del Barnes-Jewish Hospital (8038-88) e dal NHLBI (R01) HL138466, R01 HL139714). K.J.L. è supportato da NIH K08 HL123519 e Burroughs Welcome Fund (1014782).

Materials

15 mL Conocal Tubes Thermo Fisher 14-959-53A
40 µm Cell Strainers Thermo Fisher 50-828-736
50 mL Conical Tubes Thermo Fisher 352098
ACK Lysis Buffer Gibco A10492-01
Bovine Serum Albumin Sigma A2058
Collagenase 1 Sigma C0130-1G
DAPI Thermo Fisher D1306
DMEM 1x Gibco 11965-084
DNAse 1 Sigma D4527-20KU
DRAQ5 Thermo Fisher 62251
EDTA 0.5M pH 8 Corning 46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)
Fetal Bovine Serum Gibco A3840201
Forceps VWR 82027-406
HBSS 1x Gibco 14175-079
Hemostats VWR 63042-052
Hyaluronidase type 1-s Sigma H3506-500MG
PBS 1x Gibco 14190-136
Petridishes Thermo Fisher 172931
Razor Blade VWR 55411-050
Scissors VWR 82027-578

References

  1. Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
  2. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  3. Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
  4. Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  5. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  6. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  7. Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
  8. Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
  9. Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
  10. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).

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Cite This Article
Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens. J. Vis. Exp. (154), e60015, doi:10.3791/60015 (2019).

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