मानव और माउस मायोकार्डियल नमूनों से मैक्रोफेज सबसेट और स्ट्रोमल कोशिकाओं का अलगाव
Summary
यहां प्रस्तुत एंजाइमैटिक पाचन के माध्यम से एक एकल सेल निलंबन तैयार करके मानव और माउस मायोकार्डियम से मैक्रोफेज और अन्य गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट ों को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रवाह साइटोमेट्री आधारित पहचान और इक्का-दुक्का मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन के लिए गेटिंग योजनाएं भी प्रस्तुत की जाती हैं।
Abstract
मैक्रोफेज दिल में सबसे विषम और प्रचुर मात्रा में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं और हृदय की चोट के बाद सूजन और पुनः ात्मक प्रतिक्रियाओं को चलाने में केंद्रीय हैं। हृदय की चोट के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कैसे आर्केस्ट्रा करते हैं, मैक्रोफेज के विभिन्न सबसेट अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र है। यहां प्रस्तुत एक सरल प्रोटोकॉल है कि हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से प्रदर्शन करती है, माउस और स्वस्थ और रोगग्रस्त व्यक्तियों से प्राप्त मानव मायोकार्डियम नमूनों से मैक्रोफेज की निकासी के लिए। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल में एक सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए हृदय ऊतक का एंजाइमैटिक पाचन शामिल है, जिसके बाद एंटीबॉडी धुंधला होता है, और साइटोमेट्री प्रवाह होता है। यह तकनीक हल कोशिकाओं के साथ-साथ थोक और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण पर किए गए कार्यात्मक परखों के लिए उपयुक्त है। इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ इसकी सादगी, दिन-प्रतिदिन की भिन्नता और व्यापक प्रयोज्यता है जो विभिन्न माउस मॉडल और मानव रोग संस्थाओं में मैक्रोफेज विषमता की जांच की अनुमति देती है।
Introduction
मैक्रोफेज दिल में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं, और वे हृदय की चोट1,2,3,4के बाद मजबूत भड़काऊ और पुनः ात्मक प्रतिक्रियाएं पैदा करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इससे पहले, हमारे समूह ने अलग-अलग विकासात्मक मूल5,6से प्राप्त मूत्र हृदय में मैक्रोफेज के दो प्रमुख सबसेट ों की पहचान की। मोटे तौर पर, ऊतक निवासी कार्डियक मैक्रोफेज सबसेट की अलग आबादी सीसीआर 2 (सी-सी आकृति केमोकिन रिसेप्टर 2) की सेल सतह अभिव्यक्ति के आधार पर पहचानकी जा सकती है। CCR2– मैक्रोफेज (सेल सतह अभिव्यक्ति: CCR2–MHCIIकम और CCR2–MHCIIउच्च)भ्रूणमूल (आदिम और एरिथ्रोमाइलॉयड वंश) के हैं, जो आत्म-नवीनीकृत करने में सक्षम हैं, और होम्योपैथिक स्थितियों के तहत एक प्रमुख आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। निवासी CCR2+ मैक्रोफेज निश्चित हेमेटोपोइटिक मूल के हैं, मोनोसाइट्स परिसंचारी से भर्ती के माध्यम से बनाए रखा जाता है, और होमोस्टैटिक स्थितियों के तहत एक छोटी आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। कार्यात्मक रूप से, CCR2– मैक्रोफेज न्यूनतम सूजन उत्पन्न करते हैं और कोरोनरी विकास नवजात हृदय पुनर्जनन5,7के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके विपरीत, CCR2+ मैक्रोफेज हृदय अपमान के बाद मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रियाएं शुरू करते हैं और कोलैटरल कार्डियोमायोसाइट चोट, बाएं वेंट्रिकल के प्रतिकूल पुनर्मॉडलिंग और दिल की विफलता प्रगति8,9में योगदान देते हैं।
हाल ही में, हमने दिखाया है कि मानव मायोकार्डियम में मैक्रोफेज के दो अलग-अलग सबसेट भी होते हैं, जिन्हें सीसीआर 2– या सीसीआर 2+8के रूप में पहचाना जाता है। जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक विश्लेषणों से पता चला है कि मानव CCR2-और CCR2+ मैक्रोफेज कार्यात्मक रूप से अलग सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं और कार्यात्मक रूप से सीसीआर 2 के अनुरूप हैं– और माउस दिल में पाए जाने वाले CCR2+ मैक्रोफेज। मानव CCR2– मैक्रोफेज आईजीएफ 1, पीडीजीएफ, साइर61 और एचबी-ईजीएफ सहित विकास कारकों के मजबूत स्तर को व्यक्त करते हैं। सीसीआर2+ मैक्रोफेज केमोकिन्स और साइटोकिन्स में समृद्ध होते हैं जो सूजन को बढ़ावा देते हैं, जैसे आईएल-1बी, आईएल-6, सीसीएल-2, सीसीएल-7, और टीएनएफ-ए। उत्तेजित CCR2+ मैक्रोफेज संस्कृति में भड़काऊ साइटोकिन इंटरल्यूकिन-1ए (आईएल-1ए) के स्पष्ट रूप से उच्च स्तर को स्रावित करते हैं। कैसे इन सबसेट अंतर ऊतक की मरंमत के लिए योगदान और कार्डियक चोट के संदर्भ में छोड़ दिया वेंट्रिकुलर (LV) remodeling सक्रिय अनुसंधान का एक क्षेत्र बना हुआ है ।
माउस और मानव हृदय में मैक्रोफेज विषमता के प्रवाह-साइटोमेट्री आधारित विश्लेषण के लिए हृदय ऊतक को पचाने और एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है जिसके बाद प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण या सेल छंटाई के बाद आगे डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं जैसे बल्क आरएनए अनुक्रमण/एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण या कार्यात्मक रूपों के लिए कोशिकाओं को संजोना । मूत्र दिलों से एक सेल निलंबन करने के लिए मूल प्रोटोकॉल पहली बार Nahrendorf एट अल 200710में Nahrendorf समूह द्वारा सूचित किया गया. हमारी प्रयोगशाला ने मानव मायोकार्डियम से मैक्रोफेज निकालने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित और संशोधित किया है। एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करना लेकिन धुंधला और गेटिंग योजना में मामूली संशोधन के साथ, सीडी 45– मानव मायोकार्डियम से स्ट्रोमल कोशिकाओं को भी काटा जा सकता है। यहां प्रस्तुत, पाठ और वीडियो में, एक प्रोटोकॉल है कि मानव मायोकार्डियम से मैक्रोफेज या स्ट्रोमल की निकासी के लिए नियमित रूप से किया जाता है ।
कार्डियक ऊतक नमूने वयस्क रोगियों से प्राप्त किए जाते हैं, जिनमें वयस्क रोगियों को फैलाया गया कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम: इडियोपैथिक या पारिवारिक) या इस्कीमिक कार्डियोमायोपैथी (आईसीएम) बाएं वेंट्रिकुलर असिस्ट डिवाइस (एलवीएडी) प्रत्यारोपण या हृदय प्रत्यारोपण से गुजर रहा है। दिल या एलवीएडी कोर को पाचन प्रक्रिया शुरू करने से पहले ठंडे खारे के साथ इंट्रावास्कुलर रूप से छिद्रित किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ऊतक के नमूने की “गुणवत्ता” जख्म या एडीपोज ऊतक घुसपैठ की डिग्री के संदर्भ में निर्धारित मैक्रोफेज की उपज को बहुत प्रभावित कर सकती है। जख्म के बड़े क्षेत्रों के साथ दिल के नमूनों में बहुत कम सेल यील्ड होगी और वांछित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण विधियों के विट्रो सेल पुलिया की आवश्यकता होने पर गंभीर तकनीकी सीमा पैदा कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल मानव मायोकार्डियम से विभिन्न मैक्रोफेज सबसेट को निकालने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल सरल है और FACS विश्लेषण के लिए तैयार एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए 3 से 4 घंटे लगते हैं। हालांकि प्रोटोकॉ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को वाशिंगटन विश्वविद्यालय के चिल्ड्रन डिस्कवरी संस्थान और सेंट लुइस चिल्ड्रन अस्पताल (सीएच-II-2015-462, CH-II-2017-628), बार्न्स-यहूदी अस्पताल (8038-88) की नींव और NHLBI (R01) से प्रदान की गई फंडिंग से संभव बनाया गया था । एचएल138466, आर01 एचएल139714) । केजेएल को एनआईएच के08 एचएल123519 और बुर्के वेलकम फंड (1014782) द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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