Isolering av makrofager subsets och stromaceller från Human-och mus-Myokarprover

Summary

Presenteras här är ett protokoll för att isolera olika undergrupper av makrofager och andra icke-immuna celler från mänskliga och mus hjärtmuskeln genom att förbereda en enda cellsuspension genom enzymatisk matsmältning. Gating system för flödescytometri baserad identifiering och karakterisering av isolerade makrofager presenteras också.

Abstract

Makrofager representerar de mest heterogena och rikliga immunceller populationer i hjärtat och är centrala i att köra inflammation och reparativ svar efter hjärtskada. Hur olika undergrupper av makrofager iscensätta immunsvaret efter hjärtskada är ett aktivt forskningsområde. Presenteras här är ett enkelt protokoll som vårt labb utför rutinmässigt, för utvinning av makrofager från mus och mänskliga hjärtmuskeln prover som erhållits från friska och sjuka individer. Kortfattat, detta protokoll innebär enzymatisk nedbrytning av hjärtvävnad för att generera en enda cellsuspension, följt av antikropp färgning, och flödescytometri. Denna teknik är lämplig för funktionella analyser utförs på sorterade celler samt bulk och Single cell RNA sekvensering. En stor fördel med detta protokoll är dess enkelhet, minimal dag till dag variation och bred tillämplighet möjliggör utredning av makrofag heterogenitet över olika musmodeller och mänskliga sjukdomsentiteter.

Introduction

Makrofager representerar den vanligast förekommande immun cells typen i hjärtat, och de spelar betydande roller i att generera robusta inflammatoriska och reparativa svar efter hjärtskada^1,2,3,4. Tidigare identifierade vår grupp två stora undergrupper av makrofager i det murina hjärtat som härstammar från distinkta utvecklings ursprung^5,6. I stort sett, distinkta populationer av vävnad bosatt hjärt makrofage undergrupper kan identifieras baserat på cellens yta uttrycket av CCR2 (C-C motiv Chemokine receptor 2). CCR2^– makrofager (cellytan uttryck: CCR2^–mhcii^låg och CCR2^–mhcii^hög) är av embryonala ursprung (primitiva och erythromyeloid linjer), kan själv förnya, och utgör en dominerande population under homeostatiska förhållanden. Resident CCR2⁺ makrofager är av slutgiltigt hematopoietiska ursprung, upprätthålls genom rekrytering från cirkulerande monocyter, och representerar en mindre population under homeostatiska förhållanden. Funktionellt, CCR2^– makrofager generera minimal inflammation och är kritiska för koronar utveckling neonatal hjärta förnyelse^5,7. Däremot CCR2⁺ makrofager initiera robusta inflammatoriska reaktioner efter hjärt förolämpningar och bidra till säkerheter kardiomyocyte skada, negativ ombyggnad av vänster kammare, och hjärtsvikt progression^8,9.

Nyligen har vi visat att den mänskliga hjärtmuskeln innehåller också två distinkta undergrupper av makrofager identifierats på samma sätt som antingen CCR2^– eller CCR2⁺⁸. Genuttryck och funktionella analyser avslöjade att Human CCR2^– och CCR2⁺ makrofager representerar funktionellt skilda delmängder och är funktionellt analoga med CCR2^– och CCR2⁺ makrofager som finns i musens hjärta. Human CCR2^– makrofager uttrycker robusta nivåer av tillväxtfaktorer, inklusive IGF1, PDGF, CYR61 och HB-EGF. CCR2⁺ makrofager är berikade i chemokines och cytokiner som främjar inflammation, såsom Il-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7, och TNF-a. Stimulerade CCR2⁺ makrofager utsöndrar markant högre nivåer av den inflammatoriska cytokin interleukinen-1 β (Il-1 β) i kulturen. Hur dessa delmängder bidrar Differentiellt till vävnad reparation och vänsterkammari (LV) remodeling i samband med hjärtskada förblir ett område av aktiv forskning.

Flödescytometri baserad analys av makrofagheterogenitet i mus och mänskligt hjärta kräver att smälta hjärt vävnaden och generera en enda cellsuspension följt av flödescytometrisk analys eller cell sortering för ytterligare nedströms processer såsom bulk RNA sekvensering/Single cell RNA sekvensering eller odling av cellerna för funktionella analyser. Det ursprungliga protokollet för att göra en enda cellsuspension från murina Hearts rapporterades först av Nahrendorf Group i Nahrendorf et al. 2007¹⁰. Vårt labb har anpassat och modifierat protokollet för att extrahera makrofager från humant hjärtmuskeln. Med hjälp av samma protokoll men med smärre modifiering i färgning och gating system, CD45^– stromaceller från humant hjärtmuskeln kan också skördas. Presenteras här, i text och video, är ett protokoll som utförs rutinmässigt för utvinning av makrofager eller stromacellstumörer från den mänskliga myocardium.

Prover från hjärtvävnad erhålls från vuxna patienter med dilaterad kardiomyopati (DCM: idiopatisk eller familjär) eller ischemisk kardiomyopati (ICM) som genomgår implantation av vänster kammar assistans (LVAD) eller hjärttransplantation. Explanted hjärtan eller LVAD kärnar ur intravaskulärt perfunderade med kall saltlösning, innan du påbörjar digestionstillvägagångsslagen. Det är viktigt att notera att “kvalitet” av vävnadsprov bestäms i form av ärrbildning eller fettvävnad infiltration kan i hög grad påverka avkastningen av makrofager. Hjärt prov med stora områden av ärrbildning kommer att ha mycket lägre cell avkastning och kan innebära allvarliga tekniska begränsningar när önskade nedströms analysmetoder kräver in vitro-cellodling.

Protocol

Det protokoll som presenteras har godkänts av Washington University i St Louis institutions Review Board (#201305086). Alla ämnen ger informerat samtycke innan prov insamlingen och experimenten utförs i enlighet med det godkända studieprotokollet. Det presenterade protokollet utförs med godkännande av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Washington University School of Medicine och följer de riktlinjer som beskrivs i NIH guide för vård och användning av försöksdjur. <p class="jove…

Representative Results

Det protokoll som beskrivs tillåter isolering av makrofager från mus och humant myocardium. Med hjälp av samma protokoll, men med en annan färgning och gating strategi, stromaceller kan också skördas från den mänskliga myocardium. FACS resultat presenteras här förvärvades antingen på BD LSRII eller BD FACS ARIA III plattform. Kompensationskontroller genererades från enstaka färgkontroll prover från färgade splenocyter. Figur 1 visar obearbetad…

Discussion

Protokollet tillåter utvinning av olika makrofage undergrupper från humant hjärtmuskeln. Protokollet är enkelt och tar 3 till 4 timmar att förbereda Single cellsuspension redo för FACS analys. Även om protokollet är relativt enkelt att utföra, det finns vissa tekniska aspekter som måste övervägas som kommer att minimera variationer. För det första är det nödvändigt att arbeta i tid med mänsklig vävnad för optimal cellernas lönsamhet. Det är viktigt att hålla vävnaden i kallt saltlösning/HBSS för…

Materials

15 mL Conocal Tubes	Thermo Fisher	14-959-53A
40 µm Cell Strainers	Thermo Fisher	50-828-736
50 mL Conical Tubes	Thermo Fisher	352098
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2058
Collagenase 1	Sigma	C0130-1G
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM 1x	Gibco	11965-084
DNAse 1	Sigma	D4527-20KU
DRAQ5	Thermo Fisher	62251
EDTA 0.5M pH 8	Corning	46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer			490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer			976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3840201
Forceps	VWR	82027-406
HBSS 1x	Gibco	14175-079
Hemostats	VWR	63042-052
Hyaluronidase type 1-s	Sigma	H3506-500MG
PBS 1x	Gibco	14190-136
Petridishes	Thermo Fisher	172931
Razor Blade	VWR	55411-050
Scissors	VWR	82027-578