자유롭게 움직이는 마우스에서 이중 사이트 고밀도 레코딩을 위한 회수 가능한 광실리콘 프로브 및 Tetrode가 있는 하이브리드 마이크로드라이브 시스템
Summary
이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 두 개의 뇌 영역에서 9개의 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 하나의 조정 가능한 광실리콘 프로브를 이식할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이의 구성을 설명합니다. 또한 광실리콘 프로브를 여러 목적으로 안전하게 회수하고 재사용하는 방법이 입증되었다.
Abstract
다중 지역 신경 기록은 다중 두뇌 지구 사이 정밀한 기간 상호 작용을 이해하는 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 기존의 마이크로 드라이브 설계는 단일 또는 다중 영역에서 한 유형의 전극만 사용하여 단일 단위 또는 깊이 프로파일 레코딩의 수율을 제한합니다. 그것은 또한 수시로 표적 통로 및/또는 세포 모형 특정 활동을 표적으로 하는 광유전학 공구와 전극 기록을 결합하는 기능을 제한합니다. 여기에 제시된 하이브리드 마이크로드라이브 어레이는 자유롭게 마우스를 이동하여 수율을 최적화하고 마이크로드라이브 어레이의 제조 및 재사용에 대한 설명을 제시합니다. 현재 디자인은 자유롭게 움직이는 마우스에서 동시에 두 개의 서로 다른 뇌 영역에 이식 된 9 개의 테트로데스와 하나의 광 실리콘 프로브를 사용합니다. 테트로데스 와 광실리콘 프로브는 뇌의 등쪽 축을 따라 독립적으로 조절할 수 있어 단위 및 진동 활동의 수율을 극대화합니다. 이 마이크로 드라이브 어레이는 또한 장거리 신경 회로의 지역 또는 세포 유형 별 반응 및 기능을 조사하기 위해 광, 광유전학 적 조작을 중재하는 설정을 통합합니다. 또한, 광실리콘 프로브는 각 실험 후에 안전하게 회수및 재사용할 수 있다. 마이크로 드라이브 어레이는 3D 인쇄 부품으로 구성되어 있기 때문에 다양한 설정을 수용하기 위해 마이크로 드라이브의 디자인을 쉽게 수정할 수 있습니다. 먼저 설명된 마이크로드라이브 어레이의 설계및 광섬유를 광유전학 실험을 위한 실리콘 프로브에 부착하는 방법, 이어서 테트로드 번들의 제조 및 마우스 뇌에 어레이의 이식이 있다. 광유전학 적 자극과 결합 된 국소 필드 전위 및 단위 스파이크의 기록은 자유롭게 움직이는 마우스에서 마이크로 드라이브 어레이 시스템의 타당성을 보여줍니다.
Introduction
신경 활동이 학습 및 기억과 같은 인지 과정을 어떻게 지원하는지 이해하는 것이 중요합니다. 인지 작업의 근간이 되는 신경 활동의 역학을 해명하기 위해, 마이크로드라이브 어레이1,2,3의도움으로 동물에게 자유롭게 움직이는 대규모 세포외 전기생리학이 진행되고 있다. 4. 지난 2 년 동안, 마이크로 드라이브 배열의 여러 유형은 쥐에 대한여러 뇌 영역으로 전극을 이식하기 위해 개발되었다 5,6,7,8 및마우스9, 10개 , 11세 , 12. 그럼에도 불구하고, 현재의 마이크로 드라이브 설계는 일반적으로 여러 프로브 유형의 사용을 허용하지 않기 때문에 연구원은 특정 이점과 한계가있는 단일 전극 유형을 선택해야합니다. 예를 들어, tetrode 배열은 등쪽 해마 CA11,13과같은 인구 밀도가 높은 뇌 영역에 적합하며 실리콘 프로브는 해부학 적 연결을 연구하기위한 더 나은 기하학적 프로필을 제공합니다14 , 15.
테트로데스와 실리콘 프로브는 생체 내 만성 기록에 자주 사용되며 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다. Tetrodes는 비용 효율성 및 기계적 강성 외에도 단일 전극16,17보다더 나은 단일 장치 절연에서 상당한 이점을 갖는 것으로 입증되었습니다. 또한 마이크로 드라이브8,18,19,20과결합 할 때 단일 단위 활동의 높은 수율을 제공합니다. 신경 회로의 기능을 이해하기 위해 동시에 기록된 뉴런의 수를 늘리는 것이 필수적이다21. 예를 들면, 많은 수의 세포는 시간 관련22 또는 보상 코딩23 세포와 같은 기능적으로 이질적인 세포 모형의 작은 인구를 조사하기 위하여 필요합니다. 훨씬 더 높은 셀 번호는 스파이크 서열13,24,25의디코딩 품질을 향상시키는 데 필요합니다.
그러나 테트로드는 피질이나 시상과 같이 공간적으로 분포된 세포를 기록하는 데 단점이 있다. 테트로데스와 는 달리, 실리콘 프로브는 로컬구조(14,26)내에서 로컬 필드 전위(LFP) 및 스파이크 활동의 공간 분포 및 상호작용을 제공할 수 있다. 다중 생크 실리콘 프로브는 기록 사이트의 수를 더욱 증가시키고 단일또는 인접 구조물(27)에 걸쳐 기록을 허용한다. 그러나 이러한 어레이는 테로데스에 비해 전극 부지의 위치 지정에서 덜 유연하다. 또한, 복잡한 스파이크 정렬 알고리즘은 테트로데스28,29,30에의해 획득된 데이터를 미러링하기 위해 인접 채널의 동작 전위정보에 대한 정보를 추출하기 위해 고밀도 프로브에 요구된다. 따라서 단일 단위의 전체 수율은 종종 테트로데스보다 적습니다. 또한 실리콘 프로브는 취약성과 높은 비용으로 인해 불리합니다. 따라서, 테트로데스 대 실리콘 프로브의 선택은 기록의 목적에 따라 달라지며, 이는 기록 사이트에서 단일 단위 또는 공간 프로파일링의 높은 수율을 얻는 것이 우선순위에 있는지의 문제이다.
신경 활동을 기록하는 것 외에도 광유전학적 조작은 특정 세포 유형 및/또는 경로가 신경 회로 기능에 어떻게 기여하는지 조사하는 신경 과학에서 더 강력한 도구 중 하나가 되었습니다13,31, 32,33. 그러나 광유전학적 실험은 자극 광원34,35,36에섬유 커넥터를 부착하기 위해 마이크로 드라이브 어레이 설계에서 추가적인 고려가 필요하다. 종종 광섬유를 연결하려면 상대적으로 큰 힘이 필요하며, 이는 뇌의 프로브의 기계적 변화로 이어질 수 있습니다. 따라서 이식형 광섬유를 기존의 마이크로드라이브 어레이에 결합하는 것은 사소한 일이 아닙니다.
위의 이유로, 연구원은 전극의 유형 선택을 최적화하거나 기록의 목적에 따라 광섬유를 이식해야합니다. 예를 들어 테트로드는 해마1,13에서더 높은 단위 수율을 달성하기 위해 사용되며, 실리콘 프로브는 내측 내측 피질(MEC)37과같은 피질 영역의 층상 깊이 프로파일을 조사하는 데 사용된다. 현재, 테트로데스와 실리콘 프로브의 동시 이식을 위한 마이크로드라이브는 랫트5,11에대해 보고되었다. 그러나 마이크로 드라이브의 무게, 마우스 헤드의 제한된 공간 및 다른 프로브를 사용하기 위해 마이크로 드라이브를 설계하기위한 공간 요구 사항으로 인해 마우스에 여러 테트로데스 및 실리콘 프로브를 이식하는 것은 매우 어렵습니다. 마이크로 드라이브없이 실리콘 프로브를 이식 할 수 있지만,이 절차는 프로브의 조정을 허용하지 않으며 실리콘 프로브 회수(12,38)의성공률을 낮춥습니다. 또한 광유전학 적 실험은 마이크로 드라이브 어레이 설계에서 추가적인 고려 사항이 필요합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 만성 기록을 위한 마이크로드라이브 어레이를 구성하고 이식하는 방법을 보여 주며, 이를 통해 독립적으로 조절 가능한 9개의 테트로데스와 1개의 조정 가능한 광실리콘 프로브를 이식할 수 있습니다. 이 마이크로 드라이브 어레이는 또한 실리콘 프로브의 광유전학 적 실험 및 회수를 용이하게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 자유롭게 행동하는 마우스에서 실리콘 프로브를 사용하여 두 뇌 영역에서 신경 활동을 기록할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이를 구성하고 이식하는 방법을 보여줍니다. 또한 실험 후 광유전학 적 실험 및 실리콘 프로브의 회수를 보여줍니다. 조정 가능한 실리콘 프로브33 또는 광실리콘 프로브36</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일본과학해외연구동호회(HO), 부여된 장학생프로그램(TK), 인간개척과학프로그램(TK), 뇌연구재단(TK), 교수과학기술취득, 보존 프로그램 (TK), 뇌 및 행동 연구 재단 (TK), 스미토모 재단 연구 보조금 (JY), 나르사드 젊은 조사자 연구 보조금 (JY). 원고를 준비하는 동안 귀중한 의견과 제안에 대해 W. Marks에 감사드립니다.
Materials
| #00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
| #0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
| #0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
| 22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
| 23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
| 23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
| 26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
| 30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
| 3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
| 3D printer | FormLab | Form2 | |
| 5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
| aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
| conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
| customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
| customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
| dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
| dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
| Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
| drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
| electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
| epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
| eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
| fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
| fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
| gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
| ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
| headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
| impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
| mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
| optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
| Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
| ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
| silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
| silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
| silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
| silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
| silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
| silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
| skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
| standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
| super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
| surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
| Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
| tetrode wires | Sandvik | PX000004 |
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