Denne protokollen beskriver konstruksjonen av en hybrid Microdrive array som tillater implantation av ni uavhengig justerbare tetrodes og en justerbar opto-sonde i to hjerneområder i fritt bevegelige mus. Likeledes bevist er en metoden for trygg komme seg og gjenbruk det opto-Silicon sonde for mangfoldig hensikt.
Multi-regionale nevrale innspillinger kan gi viktig informasjon til å forstå fin tidsskala interaksjoner mellom flere hjerneområder. Men konvensjonelle Microdrive design ofte bare tillate bruk av én type elektrode til posten fra én eller flere regioner, begrenser avkastningen av én enhet eller dybde profil innspillinger. Det begrenser også ofte muligheten til å kombinere elektrode innspillinger med optogenetic verktøy for å målrette vei-og/eller celle type spesifikk aktivitet. Presentert her er en hybrid Microdrive array for fritt bevegelige mus for å optimalisere utbytte og en beskrivelse av fabrikasjon og gjenbruk av Microdrive array. Den nåværende design sysselsetter ni tetrodes og en opto-silisium sonde implantert i to forskjellige hjerneområder samtidig i fritt bevegelige mus. Den tetrodes og opto-silisium sonde er uavhengig justerbar langs dorsoventral aksen i hjernen for å maksimere utbyttet av enheten og oscillasjon aktiviteter. Dette Microdrive array også inkorporerer et oppsett for lys, formidling optogenetic manipulasjon for å undersøke den regionale-eller celle type-spesifikke tiltak og funksjoner av langtrekkende nevrale kretser. Dessuten, det opto-Silicon sonde kan trygg kommet til hektene og gjenbrukt etter hver eksperiment. Fordi Microdrive array består av 3D-trykte deler, kan utformingen av Microdrive enkelt endres for å imøtekomme ulike innstillinger. Først beskrevet er utformingen av Microdrive array og hvordan å feste den optiske fiber til en silisium sonde for optogenetics eksperimenter, etterfulgt av fabrikasjon av sperrende bunt og implantation av array i en mus hjernen. Innspillingen av lokale feltet potensialer og enhet skyter kombinert med optogenetic stimulering også demonstrere gjennomførbarhet av Microdrive array system i fritt bevegelige mus.
Det er avgjørende å forstå hvordan neuronal aktivitet støtter kognitiv prosess, for eksempel læring og hukommelse, ved å undersøke hvordan ulike hjerneområder dynamisk samhandler med hverandre. Til belyse dynamikk av Neural aktivitet underliggende kognitive oppgaver, stor skala ekstracellulære elektrofysiologi har vært gjennomført i fritt bevegelige dyr ved hjelp av Microdrive arrays1,2,3, firetil. I de siste to ti årene har flere typer Microdrive array blitt utviklet til implantat elektroder i flere hjerneområder for rotter5,6,7,8 og mus9, 10 andre , 11 flere , 12. likevel tillater gjeldende Microdrive design generelt ikke for bruk av flere sonde typer, tvinger forskerne til å velge en enkelt elektrode type med spesifikke fordeler og begrensninger. Sperrende arrays fungerer for eksempel bra for tett befolkede områder i hjernen, slik som rygg hippocampus CA11,13, mens silisium sonder gir en bedre geometrisk profil for å studere anatomiske forbindelser14 , 15av dem.
Tetrodes og silisium sonder brukes ofte til in vivo kronisk opptak, og hver har sine egne fordeler og ulemper. Tetrodes har vist seg å ha betydelige fordeler i bedre enkelt enhet isolasjon enn enkelt elektroder16,17, i tillegg til kostnadseffektivitet og mekanisk stivhet. De gir også høyere avkastning av enkelt enhet aktiviteter når kombinert med Microdrive8,18,19,20. Det er viktig å øke antall samtidig registrert neurons for å forstå funksjonen av nevrale kretser21. For eksempel er et stort antall celler nødvendig for å undersøke små populasjoner av funksjonelt heterogene celletyper som tidsrelaterte22 eller belønning koding23 celler. Mye høyere celle tall er nødvendig for å forbedre dekoding kvaliteten på pigg sekvenser13,24,25.
Tetrodes, derimot, har en ulempe i innspillingen romlig distribuerte celler, for eksempel i cortex eller thalamus. I motsetning til tetrodes, Silicon sonder kan gi romlig distribusjon og samhandling av lokale felt potensialer (LFPs) og skyter aktiviteter innenfor en lokal struktur14,26. Multi-skaft silisium sonder ytterligere øke antall opptak nettsteder og tillate opptak over singel eller nabo strukturer27. Slike matriser er imidlertid mindre fleksible i plasseringen av elektrode områder sammenlignet med tetrodes. I tillegg er komplekse Spike sortering algoritmer som kreves i høy tetthet sonder å trekke ut informasjon om tiltak potensialer for nabokommunene kanaler å speile data ervervet av tetrodes28,29,30. Derfor er den totale avkastningen av enkeltenheter ofte mindre enn tetrodes. Videre silisium sonder er ugunstig på grunn av deres skjørhet og høye kostnader. Dermed er valget av tetrodes vs silisium sonder avhengig av målet for innspillingen, som er et spørsmål om å få en høy avkastning på single-enheter eller romlig profilering på innspillingen steder er prioritert.
I tillegg til å registrere neural aktivitet, har optogenetic manipulasjon blitt en av de kraftigere verktøy i nevrovitenskap for å undersøke hvordan spesifikke celletyper og/eller trasé bidra til neural Circuit funksjoner13,31, 32,33. Optogenetic eksperimenter krever imidlertid ekstra overveielse i Microdrive array design for å feste fiber kontakten til stimulering av lyskilder34,35,36. Ofte kobler fiber-optikk krever en relativt stor kraft, noe som kan føre til en mekanisk forskyvning av sonden i hjernen. Derfor er det ikke en triviell oppgave å kombinere en implanterbare optisk fiber til konvensjonelle Microdrive arrays.
For de ovennevnte grunner, er forskere pålagt å optimalisere valg av type elektrode eller implantatet en optisk fiber avhengig av målet for innspillingen. For eksempel tetrodes brukes til å oppnå høyere enhet yield i hippocampus1,13, mens silisium sonder brukes til å undersøke laminær dybde profil av kortikale områder, slik som den midtre entorhinal cortex (MEC)37. For tiden hadde Microdrive for simultan implantation av tetrodes og silisium sonder blitt rapportert for rotter5,11. Det er imidlertid svært utfordrende å implantatet flere tetrodes og silisium sonder i mus på grunn av vekten av Microdrive, begrenset plass på musen hodet, og romlige krav for å designe Microdrive å ansette ulike sonder. Selv om det er mulig å implantatet silisium sonder uten Microdrive, denne fremgangsmåten tillater ikke for justering av sonden og senker suksessraten av silisium-sonde utvinning12,38. Videre optogenetic eksperimenter krever flere hensyn i Microdrive array design. Denne protokollen demonstrerer hvordan man konstruerer og implantatet en Microdrive array for kronisk opptak i fritt bevegelige mus, som tillater implantation av ni uavhengig justerbare tetrodes og en justerbar opto-silisium sonde. Denne Microdrive array Letter også optogenetic eksperimenter og gjenvinning av silisium sonde.
Protokollen demonstrerer hvordan å konstruere og implantat en hybrid Microdrive array som gjør opptak av nevrale aktiviteter fra to hjernen områder ved hjelp av uavhengige justerbare tetrodes og en silisium-sonde i fritt oppfører mus. Det demonstrerer også optogenetic eksperimenter og utvinning av silisium sonden etter eksperimenter. Mens justerbar silisium sonde33 eller opto-silisium sonde36 implantation er påvist tidligere i mus, har denne protokollen klare fordeler…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet delvis av Japan Society for fremme av science Overseas Research stipend (HO), utrustet Scholar program (TK), Human Frontier Science program (TK), Brain Research Foundation (TK), fakultet vitenskap og teknologi oppkjøp og Bevaring program (TK), Brain & Behavior Research Foundation (TK), og av The Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD unge etterforsker Research Grant (JY). Vi takker W. merker for verdifulle kommentarer og forslag under utarbeidelsen av manuskriptet.
#00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
#0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
#0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
3D printer | FormLab | Form2 | |
5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
tetrode wires | Sandvik | PX000004 |