Sistema microdrive ibrido con sonda Opto-Silicon recuperabile e tetrode per la registrazione ad alta densità a doppio sito in mouse in movimento libero
Summary
Questo protocollo descrive la costruzione di un array ibrido di microdrive che consente l’impianto di nove tetrodi regolabili in modo indipendente e una sonda opto-silicone regolabile in due regioni cerebrali in topi in movimento libero. Di dimostrato è anche un metodo per recuperare e riutilizzare in modo sicuro la sonda opto-silicone per molteplici scopi.
Abstract
Le registrazioni neurali multi-regionali possono fornire informazioni cruciali per comprendere le interazioni della scala cronologica fine tra più regioni del cervello. Tuttavia, i progetti di microtrasmissioni convenzionali spesso consentono l’uso di un solo tipo di elettrodo per registrare da regioni singole o multiple, limitando la resa delle registrazioni del profilo a unità singola o di profondità. Spesso limita anche la capacità di combinare le registrazioni degli elettrodi con strumenti optogenetici per indirizzare l’attività specifica del percorso e/o del tipo di cellula. Qui è presentato un array di microdrive ibrido per mouse liberamente in movimento per ottimizzare la resa e una descrizione della sua fabbricazione e riutilizzo dell’array di microdrive. L’attuale progetto impiega nove tetrodi e una sonda opto-silicone impiantata in due diverse aree cerebrali contemporaneamente in topi liberamente in movimento. I tetrodi e la sonda opto-silicone sono regolabili in modo indipendente lungo l’asse dorsoventrale nel cervello per massimizzare la resa delle attività di unità e oscillatorie. Questo array di microdrive incorpora anche un set-up per la manipolazione optogenetica leggera e di mediazione per studiare le risposte e le funzioni specifiche del tipo di cellule o regionali o dei circuiti neurali dei circuiti neurali a lungo raggio. Inoltre, la sonda opto-silicone può essere recuperata in modo sicuro e riutilizzata in modo sicuro dopo ogni esperimento. Poiché l’array di microdrive è costituito da parti stampate in 3D, la progettazione di microdrive può essere facilmente modificata per adattarsi a varie impostazioni. Primo descritto è la progettazione dell’array di microdrive e come collegare la fibra ottica a una sonda di silicio per esperimenti di optogenetica, seguita dalla fabbricazione del fascio di tetrodo e dall’impianto dell’array in un cervello di topo. La registrazione dei potenziali sul campo locale e dell’unità di spinking combinata con la stimolazione optogenetica dimostrano anche la fattibilità del sistema di micro-operatori in topi in movimento libero.
Introduction
È fondamentale capire come l’attività neuronale supporta il processo cognitivo, come l’apprendimento e la memoria, studiando come diverse regioni del cervello interagiscono dinamicamente tra loro. Per chiarire le dinamiche dell’attività neurale alla base dei compiti cognitivi, l’elettrofisiologia extracellulare su larga scala è stata condotta in animali liberamente in movimento con l’aiuto di array di microdrive1,2,3, 4. Negli ultimi due decenni, diversi tipi di array di microdrive sono stati sviluppati per impiantare elettrodi in più regioni cerebrali per ratti5,6,7,8 e topi9, 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12.Tuttavia, gli attuali progetti di microtrasmissioni generalmente non consentono l’uso di più tipi di sonde, costringendo i ricercatori a scegliere un singolo tipo di elettrodo con vantaggi e limitazioni specifici. Ad esempio, gli array di tetrodo funzionano bene per regioni cerebrali densamente popolate come l’ippocampo dorsale CA11,13, mentre le sonde in silicio danno un profilo geometrico migliore per studiare le connessioni anatomiche14 , 15.
Tetrodi e sonde in silicio sono spesso utilizzati per la registrazione cronica in vivo, e ognuno ha i propri vantaggi e svantaggi. Tetrode hanno dimostrato di avere vantaggi significativi in un migliore isolamento unità singola rispetto agli elettrodi singoli16,17, oltre all’efficacia dei costi e rigidità meccanica. Forniscono inoltre maggiori rese di attività a unità singola se combinate con microdioni8,18,19,20. È essenziale aumentare il numero di neuroni registrati contemporaneamente per comprendere la funzione dei circuiti neurali21. Ad esempio, è necessario un gran numero di cellule per studiare piccole popolazioni di tipi di cellule funzionalmente eterogenee, come22 celle correlate al tempo o codici di ricompensa23 celle. Sono necessari numeri di cella molto più alti per migliorare la qualità di decodifica delle sequenze di picco13,24,25.
I tetrodi, tuttavia, hanno uno svantaggio nella registrazione di cellule distribuite spazialmente, come nella corteccia o nel talamo. A differenza dei tetrodi, le sonde in silicio possono fornire la distribuzione spaziale e l’interazione dei potenziali di campo locale (LFP) e le attività di chiodare all’interno di una struttura locale14,26. Le sonde in silicio multi-shank aumentano ulteriormente il numero di siti di registrazione e consentono la registrazione su strutture singole o vicine27. Tuttavia, tali array sono meno flessibili nel posizionamento dei siti di elettrodi rispetto ai tetrodi. Inoltre, sono necessari complessi algoritmi di ordinamento dei picchi nelle sonde ad alta densità per estrarre informazioni sui potenziali d’azione dei canali vicini per specchiare i dati acquisiti dai tetrodi28,29,30. Di conseguenza, la resa complessiva delle singole unità è spesso inferiore a i tetrodi. Inoltre, le sonde in silicio sono svantaggiose a causa della loro fragilità e dei costi elevati. Pertanto, la scelta delle sonde tetrodi contro silicio dipende dall’obiettivo della registrazione, che è una questione di ottenere un alto rendimento di unità singole o profilazione spaziale nei siti di registrazione è prioritaria.
Oltre a registrare l’attività neurale, la manipolazione optogenetica è diventata uno degli strumenti più potenti in neuroscienza per esaminare come specifici tipi di cellule e/o percorsi contribuiscono alle funzioni del circuito neurale13,31, 32,33. Tuttavia, gli esperimenti optogenetici richiedono un’ulteriore considerazione nella progettazione di array di microdrive per collegare il connettore in fibra per stimolare le sorgenti luminose34,35,36. Spesso, il collegamento di fibre ottiche richiede una forza relativamente grande, che può portare a uno spostamento meccanico della sonda nel cervello. Pertanto, non è un compito banale combinare una fibra ottica impiantabile agli array di microdrive convenzionali.
Per i motivi di cui sopra, i ricercatori sono tenuti a ottimizzare la selezione del tipo di elettrodo o per impiantare una fibra ottica a seconda dello scopo della registrazione. Ad esempio i tetrodi vengono utilizzati per ottenere una maggiore resa unitaria nell’ippocampo1,13, mentre le sonde di silicio vengono utilizzate per studiare il profilo di profondità laminare delle aree corticali, come la corteccia entorinale medianale (MEC)37. Attualmente, microdrive per l’impianto simultaneo di tetrodi e sonde di silicio erano stati segnalati per i ratti5,11. Tuttavia, è estremamente difficile impiantare più tetrodi e sonde in silicio nei topi a causa del peso dei microdrive, dello spazio limitato sulla testa del mouse e dei requisiti spaziali per la progettazione del microdrive per impiegare sonde diverse. Sebbene sia possibile impiantare sonde in silicio senza micromotore, questa procedura non consente la regolazione della sonda e abbassa il tasso di successo del recupero della sonda di silicio12,38. Inoltre, gli esperimenti optogenetici richiedono considerazioni aggiuntive nella progettazione di array di microdrive. Questo protocollo dimostra come costruire e impiantare un array di microdrive per la registrazione cronica in topi liberamente in movimento, che consente l’impianto di nove tetrodi regolabili in modo indipendente e una sonda opto-silicone regolabile. Questo array di microdrive facilita anche gli esperimenti optogenetici e il recupero della sonda di silicio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo dimostra come costruire e impiantare un array ibrido di microdrive che consente la registrazione di attività neurali da due aree cerebrali utilizzando tetrodi regolabili indipendenti e una sonda di silicio in topi che si comportano liberamente. Dimostra anche esperimenti optogenetici e il recupero della sonda di silicio dopo gli esperimenti. Mentre la sonda in silicone regolabile33 o l’impianto 36 della sonda opto-silicio sono dimostrati in precedenza nei top…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (HO), Endowed Scholar Program (TK), Human Frontier Science Program (TK), Brain Research Foundation (TK), Faculty Science and Technology Acquisition e Retention Program (TK), Brain & Behavior Research Foundation (TK), e dalla Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young Investigator Research Grant (JY). Ringraziamo W. Marks per preziosi commenti e suggerimenti durante la preparazione del manoscritto.
Materials
| #00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
| #0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
| #0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
| 22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
| 23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
| 23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
| 26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
| 30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
| 3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
| 3D printer | FormLab | Form2 | |
| 5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
| aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
| conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
| customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
| customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
| dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
| dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
| Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
| drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
| electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
| epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
| eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
| fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
| fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
| gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
| ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
| headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
| impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
| mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
| optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
| Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
| ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
| silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
| silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
| silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
| silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
| silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
| silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
| skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
| standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
| super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
| surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
| Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
| tetrode wires | Sandvik | PX000004 |
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