Hier stellen wir ein Protokoll zur minimalinvasiven chirurgischen Läsion von Muskeln vor, die dem Fütterungsapparat der Meeresmolluske Aplysia californica innewohnen, um die Rolle dieser Muskeln während des Fütterungsverhaltens zu verstehen.
Aplysia californica ist ein Modellsystem zur Untersuchung der neuronalen Kontrolle von Lernen und Verhalten. Dieses Tier verfügt über ein halboffenes Kreislaufsystem, das es ermöglicht, auf viele seiner inneren Strukturen zuzugreifen, ohne nennenswerte Schäden zu verursachen. Viele Manipulationen können sowohl in vivo als auch in vitro leicht durchgeführt werden, was es zu einem hochgradig transportablen Modell für die Analyse von Verhalten und neuronalen Schaltkreisen macht. Um die Funktionen der Muskeln innerhalb des Futtergreifers besser zu verstehen, haben wir eine Technik entwickelt, um sie zu läsionen, ohne die Hauptkörperhöhle des Tieres zu öffnen oder die äußeren Schichten des Fütterungsorgans (d.h. die bukkale Masse) zu beschädigen. Bei dieser Technik wird der Greifer teilweise immer wieder verzahnt, was einen direkten Zugang zur Muskulatur ermöglicht. Dieses Verfahren ermöglicht es Tieren, sich schnell und zuverlässig zu erholen. Dies hat es ermöglicht, die I7-Muskeln und subradulären Fasern zu läsion, so dass wir zeigen, dass beide Muskeln wesentlich zur Öffnung in vivo beitragen.
Das Fütterungssystem von Aplysia californica hat eine lange Geschichte der Verwendung als Modellsystem für das Verständnis von Lernen und Gedächtnis1, motivierte Verhaltensweisen2,3, und die Interaktion zwischen Verhalten, Biomechanik und neuronale Steuerung während der Fütterung4. Es hat hoch zugängliche neuronale Schaltungen, mit einer relativ kleinen Anzahl von großen, identifizierbaren Neuronen. Das Tier verfügt über ein halboffenes Kreislaufsystem, das es ermöglicht, auf viele seiner inneren Strukturen zuzugreifen, ohne nennenswerte Schäden zu verursachen. Es ist auch robust für viele Manipulationen sowohl in vivo als auch in vitro, so dass es ein hoch gradlierbares Modell für die Analyse von Verhalten und neuronalen Schaltkreisen.
Um die neuronalen Muster zu verstehen, die zu Fütterungsverhalten führen, ist es wichtig, die zugrunde liegende Mechanik der weichen Struktur zu beschreiben, aus der das Fütterungsorgan besteht, die bukkale Masse4. Während es Arbeit getan wurde, um die äußeren Muskeln zu charakterisieren, die die bukkale Massebilden 5,6, die inneren Muskeln der zugrunde liegenden Struktur innerhalb der bukkalen Masse, die die Oberfläche des Greifers steuert, die Odontophore, wurden für In-vivo-Experimente weitgehend unzugänglich. Obwohl es In-vitro-Studien über die Funktionen einiger dieser Muskeln7,8, der Mangel an direktem Zugang zu diesen Muskeln hat es schwierig gemacht, ihre Rolle bei intakten, verhaltenden Tieren zu studieren.
Die meisten Techniken für Elektrodenimplantation oder Läsionen in Aplysien oder ähnlichen mollusken Arten erfordern, dass die Körperwand geöffnet werden9,10,11,12. Das Öffnen der Körperwand verursacht Epithelverletzungen, und der Schnitt muss sicher versiegelt werden, um eine Hämolymphe zu verhindern. Noch ernstere Schwierigkeiten ergeben sich beim Versuch, die inneren Muskeln des Greifers von Aplysia (Muskeln, die der Radularoberfläche oder innerhalb des Odontophores zugrunde liegen) zu erreichen: Nachdem man durch die Hauptkörperhöhle eingetreten ist, muss man dann durch einige Teil der Muskelwand der bukkalen Masse, um Zugang zu den inneren Strukturen zu erhalten (Abbildung 1A). Diese akkumulierte Verletzung und Zugangsschwierigkeiten haben den Ansatz mit herkömmlichen Mitteln problematisch gemacht, da sich die Tiere nicht gut von diesen Operationen erholen (von Tieren mit vollen Eversionen haben nur 17% eine Fütterungsfähigkeit wiedererlangt, N = 12. Rund 85 % der Tiere ohne Entbehrlichkeit erhielten die Fähigkeit zu füttern, N = 84).
Der I7-Muskel, der als Radularöffner8charakterisiert wurde, befindet sich tief im Odontophore selbst, was den Zugang weiter erschwert. Es erstreckt sich zwischen der Basis des Radularstiels (Abbildung 1C) und der Unterseite der Radularoberfläche, durch ein Lumen im Odontophore (Abbildung 1C). Auf drei Seiten der I7 Muskeln sind Wände von Muskeln, und die vierte Wand besteht aus dem radulären Stiel. Für die Zwecke einer biomechanischen Studie würde eine größere Beeinträchtigung einer dieser Strukturen die normale Funktion des Fütterungsgeräts beeinträchtigen. Wir entwickelten einen neuartigen Ansatz, den Odontophore durch die Kiefer herauszuarbeiten und die Operation durch einen Schnitt auf die dünne, knorpelförmige Radularoberfläche durchzuführen, der es ermöglichte, den I7-Muskel sowie neu beschriebene feine Muskelfasern, die direkt unter der Radularoberfläche verlaufen, die wir als die subradularen Fasern bezeichnen (Abbildung 1C).
Abbildung 1: Anatomische Übersicht. (A) Lage der bukkalen Masse innerhalb von Aplysia. (B) Externe Anatomie des Odontophores. Die Oberfläche von Radula und Radularsack sind gelb; Muskeln, die das Odontophore komponieren, werden in Rot dargestellt, basierend auf ihren tatsächlichen Farben. (C) SagittalAbschnitt von Odontophore, zeigt die Lage der subradularen Fasern (gekrümmte rosa Linie) und I7 Muskel (gerade rosa Linie). Der Querschnitt des I6-Muskels ist dunkelrot dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die wichtigsten Schritte innerhalb des Protokolls sind die Notwendigkeit, sicherzustellen, dass das Tier vollständig beästhetisiert wird, und dass die Eversion der bukkalen Masse gerade genug ist, um auf die zugrunde liegenden Muskeln zuzugreifen. Es kann einige Praxis erfordern, um diese Schritte zu perfektionieren, aber sobald sie gemeistert sind, ist die Ausbeute aus Operationen wahrscheinlich größer als 85% aller durchgeführten Experimente. Der wichtigste Weg, um das Protokoll richtig zu ändern und zu beheben, ist, Zeit damit zu verbringen, Die bukkalen Massen zu zerlegen, so dass die Positionen der internen Muskeln für den Prüfer vollständig klar sind. Da der vorgeschlagene Schnitt durch die Radularoberfläche unweigerlich einige Schäden an den darunter liegenden subradulären Fasern verursacht, kann es sinnvoll sein, die genaue Position des Einschnitts zu ändern, um bestimmte Bereiche dieser Fasern zu vermeiden.
Eine Einschränkung der chirurgischen Technik ist, dass es unspezifische Auswirkungen auf Fütterungsreaktionen haben kann, wie die Stärke der Protraktion. Eine Möglichkeit, diese Einschränkung zu überwinden, besteht darin, dass Tiere als ihre eigenen Kontrollen dienen. Darüber hinaus ist es wichtig, eine Scheinläsionsgruppe zu haben, die dem gesamten chirurgischen Protokoll unterworfen ist, mit Ausnahme der Entfernung des spezifischen Muskels (d. h. I7 oder der SRFs). Durch die Befolgung dieser Vorschläge wird ein Prüfer die Auswirkungen der Variabilität zwischen Tieren reduzieren und ein intrinsisches Maß für die unspezifischen Auswirkungen einer Operation haben.
Frühere Arbeit hat Ansätze durch die Körperwand verwendet, um Läsion oder Aufzeichnen entweder von Nerven13,14, oder Muskeln15,16,17. In unserem Labor haben wir anekdotisch beobachtet, dass Körperwandschnitte oft mit einem signifikanten Verlust der Hämolymphe und damit des Körpervolumens einhergehen. Tiere benötigen oft mehrere Tage, um sich davon zu erholen, und wenn die Körperwandläsion nicht sorgfältig vernässt ist, können sich die Tiere nicht erholen. Darüber hinaus zeigt die post-mortem Untersuchung der Tiere erhebliche Narben um den Schnitt und eine starke Immunantwort (anekdotische Beobachtungen). Im Gegensatz dazu zeigen Tiere nach der Erholung von dem hier beschriebenen Protokoll (basierend auf Beobachtungen an 96 Tieren) keinen Verlust der Hämolymphe oder Veränderung des Körpervolumens.
Zukünftige Anwendungen der Technik können es auf andere Muskeln innerhalb des Fütterungsapparates von Aplysia und auf andere Tiere ausdehnen. Wir haben uns auf die Entfernung der I7-Muskel- und Subradularfasern konzentriert. Dieselben allgemeinen chirurgischen Techniken ermöglichen auch den Zugang zu den meisten anderen Muskeln des Odontophore. Einige davon, wie der innere Teil des I5-Muskels, sind am besten über die Radularoberfläche zugänglich. Andere, wie die inneren Flugblätter von I4, können besser durch das äußere Epithel des Odontophore erreicht werden. Wir haben Vorversuche gemacht, bei denen ein Schnitt unter der Radularspalte des teilweise immerklichen Odontophores den Zugang für einen geschärften Haken ermöglichte,der dann verwendet werden könnte, um einen anderen Muskel innerhalb des Odontophore, Muskel I8 8, zu läsionen. Da das hier beschriebene Operationsprotokoll die Hauptkörperhöhle nicht öffnet, ist keine Naht erforderlich.
Das Protokoll, das wir beschrieben haben, könnte von allgemeinem Interesse für andere Forscher sein, die an Weichteilstrukturen arbeiten, die sonst schwer zu manipulieren wären, z. B. die Fütterungsvorrichtung anderer Weichtiere. Ganz allgemein könnte dieses Protokoll andere neuartige chirurgische Ansätze zur Analyse weicher Strukturen wie Zungen, Stämme oder Tentakel vorschlagen18.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten die harte Arbeit würdigen, die Sherry Niggel, Sisi Lu und Joey Wu in die Verbesserung und Validierung dieser Protokolle gesteckt haben. Diese Arbeit wurde von NSF Grant IOS 1754869 unterstützt.
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Webcam | Logitech | c920 | for recording data |