Tredimensionel Co-kultur sfærisk angiogenese assay system er designet til at efterligne den fysiologiske angiogenese. Co-kultur sfæroider er dannet af to humane vaskulære celler prækursorer, ECFCs og MSCs, og indlejret i kollagen gel. Det nye system er effektivt til at evaluere angiogene modulatorer og giver mere relevant information til in vivo-studiet.
Undersøgelser inden for angiogenese har været aggressivt voksende i de sidste par årtier med anerkendelsen af, at angiogenese er et kendetegn for mere end 50 forskellige patologiske tilstande, såsom reumatoid arthritis, oculopati, hjerte-kar-sygdomme og tumor metastaser. Under angiogenese Drug udvikling, det er afgørende at bruge in vitro-analysesystemer med passende celletyper og ordentlige forhold til at afspejle den fysiologiske angiogenese proces. For at overvinde begrænsningerne af nuværende in vitro-angiogenese-analysesystemer, der primært anvender endotelceller, udviklede vi et 3-dimensionalt (3D) sfærisk spiring-analyse system. Co-Culture sfæroider blev produceret af to humane vaskulære celle prækursorer, endotel kolonidannende celler (ecfcs) og mesenchymal stamceller (MSCS) med et forhold på 5 til 1. ECFCs + MSCs sfæroider blev indlejret i type I kollagen matrix for at efterligne det in vivo ekstracellulære miljø. En real-time celle optager blev udnyttet til løbende at observere progression af angiogen spiring fra sfæroider for 24 h. levende celle fluorescerende mærkning teknik blev også anvendt til at kanal lokaliseringen af hver celletype under spire dannelse. Angiogenisk potentiale blev kvantificeret ved at tælle antallet af spirer og måle den kumulative længde af spirer genereret fra de enkelte sfæroider. Fem tilfældigt udvalgte sfæroider blev analyseret pr. forsøgsgruppe. Sammenlignings eksperimenter viste, at ECFCs + MSCs sfæroider udviste større spire nummer og kumulativ spire længde sammenlignet med kun ECFCs-sfæroider. Bevacizumab, en FDA-godkendt angiogenesehæmmer, blev testet med det nyudviklede Co-Culture sfæroide-analyse system for at verificere dets potentiale til at screene anti-angiogeniske lægemidler. IC50 -værdien for ecfcs + MSCS-sfæroider sammenlignet med Sfæroider i ecfcs var tættere på den effektive plasmakoncentration af bevacizumab opnået fra xenograft tumor musemodel. Den nuværende undersøgelse tyder på, at 3D ecfcs + MSCS sfæroide angiogenese assay system er relevant for fysiologisk angiogenese, og kan forudsige en effektiv plasmakoncentration forud for dyreforsøg.
Ca. 500.000.000 mennesker verden over forventes at drage fordel af angiogenesis-moduerende terapi for vaskulære misdannelser-associerede sygdomme som reumatoid arthritis, oculopati, hjerte-kar-sygdomme, og tumor metastaser1. Således er udviklingen af lægemidler, der kontrollerer angiogenese blevet et vigtigt forskningsområde i den farmaceutiske industri. I løbet af narkotika udviklingsprocessen, in vivo dyreforsøg er nødvendig for at undersøge virkningerne af Drug kandidater på fysiologiske funktioner og systemiske interaktioner mellem organer. Etiske og omkostningsspørgsmål har imidlertid øget bekymringerne vedrørende dyreforsøg2. Der er derfor behov for forbedrede in vitro-analysesystemer for at opnå mere nøjagtige og forudsigelige data, der fører til bedre beslutningstagning før dyreforsøg. Nuværende in vitro angiogenese assays normalt måle spredning, invasion, migration, eller rørformede struktur dannelse af endotelceller (ECs) seedet i to-dimensionelle (2D) kultur plader3. Disse 2D angiogenese assays er hurtige, enkle, kvantitative og omkostningseffektive, og har i væsentlig grad bidraget til opdagelsen af angiogenese-modulerende stoffer. Der er dog stadig flere spørgsmål, som skal forbedres.
Sådanne 2D in vitro-analysesystemer kan ikke afspejle komplekse flertrinshændelser af angiogenese, der forekommer under in vivo fysiologiske forhold, hvilket fører til unøjagtige resultater, der forårsager uoverensstemmelser mellem in vitro-analysedata og kliniske forsøgsresultater4. 2D-kulturforhold inducerer også ændring af cellulære fænotyper. For eksempel, efter spredning i 2D kultur plader, ECs har en svag cellulær fænotype som manifesteret ved reduceret ekspression af CD34 og flere signaler, der regulerer cellulære svar5,6. For at overvinde begrænsningerne i 2D-kulturbaserede angiogenese-analysesystemer er tre-dimensionelle (3D) sfæriske angiogeneseanalysessystemer blevet udviklet. Spiring efterfulgt af rørformede struktur dannelse fra sfæroider dannet af ECs afspejle in vivo neo-vascularization processer7,8. Således, 3D sfæroide angiogenese assay er blevet betragtet som en effektiv analyse system til screening potentielle Pro-eller anti-angiogenese narkotika.
De fleste 3D sfæroide angiogenese assays udnytter kun ECs, hovedsageligt humane navle formede vene endotelceller (huvecs) eller humane dermal microvaskulære endotelceller (hdmecs) til at fokusere på den cellulære respons af ECs under angiogenese. Men, blod kapillærer er sammensat af to celletyper: ECs og pericytes. Udarbejdelse af tovejsinteraktion mellem ECs og pericytes er afgørende for korrekt vaskulær integritet og funktion. Flere sygdomme, såsom arveligt slagtilfælde, diabetisk retinopati, og venøs misdannelse, er forbundet med ændret pericyte tæthed eller nedsat pericyte fastgørelse til endotelet9. Pericytes er også kendt som et centralt element i angiogen proces. Pericytes rekrutteres til at stabilisere nydannede fartøjs strukturer ved ECs. I denne henseende, mono-kultur sfæroide angiogenese assay ikke indarbejde pericytes7,10. Derfor kan Co-Culture sfæroider dannet af ECs og pericytes give en værdifuld tilgang til mere nøje efterligne fysiologisk angiogen hændelser.
Den foreliggende undersøgelse havde til formål at udvikle en 3D Co-kultur sfæriske angiogenese-assay med en kombination af humane endotel kolonidannende celler (ECFCs) og mesenchymal stamceller (MSCs) til mere nøje at afspejle in vivo angiogenese. Co-Culture sfæroide system som en in vitro-repræsentation af et normalt blodkar blev først etableret af korff et al. i 200111. De kombinerede HUVECs og humane navlestrengs glatte muskelceller (HUSMCs), og viste, at co-kultur af to modne vaskulære celler faldt spiring potentiale. Moden ECs (huvecs) er kendt for gradvist at miste deres evne til at formere sig og differentiere, hvilket negativt påvirker deres angiogenese svar12,13. Modne perivaskulære celler (HUSMCs) kan forårsage endotel celle inaktivering gennem ophævelse af den vaskulære endotelial vækstfaktor (VEGF) reaktionsevne11. Den væsentligste forskel mellem Korffs og vores co-Culture sfæroide-system er de anvendte celletyper. Vi anvendte to vaskulære prækursorer, ecfcs og MSCS, at etablere en ordentlig angiogenese assay system til at screene og undersøge Pro-eller-anti-angiogene agenter. ECFCs er forløberen for ECs. ECFCs har robust spredningskapacitet sammenlignet med modne ECs14, som gør det muligt at overvinde begrænsningen af ECS. Ecfcs bidrager til ny fartøjs dannelse i mange postnatale patofysiologiske tilstande15,16,17. MSCS er pluripotente stamceller, der har kapacitet til at differentiere sig til pericytes og dermed bidrage til angiogenese18,19.
I tidligere rapporter viste ecfcs og MSCS synergistiske virkninger på in vitro-rørdannelse20, in vivo neo-vascularization21,22og forbedret reperfusion af iskæmisk væv23,24. I denne undersøgelse blev ECFCs og MSCs anvendt til at danne Co-kultur sfæroider og indlejret i type I collagen gel for at afspejle et in vivo 3D miljø. Kollagen betragtes som en vigtig bestanddel af den ekstracellulære matrix (ECM) omkring ECs25. ECM spiller en afgørende rolle i reguleringen af celle adfærd26. Den analyse protokol, der foreslås her, kan nemt og hurtigt udføres inden for to dage ved hjælp af fælles laboratorieteknikker. For effektiv celle sporing under spiring proces, kan hver celletype fluorescently mærket og overvåges ved hjælp af en real-time celle optager. Det nyoprettede 3D Co-Culture sfæroide angiogenese-analyse system er designet til at øge følsomheden for at evaluere potentielle angiogene modulatorer og give forudsigelige oplysninger forud for in vivo-studiet.
I nærværende undersøgelse indføres et forbedret in vitro-angiogeneseanalysesystem, der udnytter Co-kultursfæroider dannet af to humane vaskulære celle progenitorer, ecfcs og MSCS. co-Culture sfæroide-systemet kan efterligne in vivo vaskulær spire dannelse, opnås ved interaktion og inkorporering mellem endotelceller og pericytes. Sammenlignet med andre in vitro-angiogenese-assays, der kun afspejler ECs-medieret angiogenese, er dette Co-Culture-analyse system mere repræsentativt for den multitrinskaskade af fysio…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af et tilskud (17172MFDS215) fra ministeriet for fødevarer og narkotika sikkerhed, National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud, der finansieres af Korea Government (MSIP) (2017R1A2B4005463), og det grundlæggende videnskabelige forsknings program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2016R1A6A1A03007648).
0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |