Трехмерная система ассеаа ассеа ангиогенеза с использованием сокультурных сфероидов, сформированных эндотелиальными колоний формирования клеток и мезенхимальных стволовых клеток
Summary
Трехмерная система сфероидного ангиогенеза, трехмерная со-культура, предназначена для имитации физиологиического ангиогенеза. Сокультурные сфероиды образуются двумя прекурсорами сосудистых клеток человека, ECFCs и MSCs, и встроены в коллагенный гель. Новая система эффективна для оценки ангиогенных модуляторов и предоставляет более актуальную информацию для исследования in vivo.
Abstract
Исследования в области ангиогенеза были агрессивно растет в последние несколько десятилетий с признанием того, что ангиогенез является отличительной чертой более 50 различных патологических условий, таких как ревматоидный артрит, окулопатия, сердечно-сосудистые заболевания , и метастазопухоли опухоли. Во время развития препарата ангиогенез, очень важно использовать в пробирке системы анализа с соответствующими типами клеток и надлежащих условий, чтобы отразить процесс физиологии ангиогенеза. Чтобы преодолеть ограничения текущих систем анализа in vitro angiogenesis, использующих в основном эндотелиальные клетки, мы разработали трехмерную (3D) систему анализа сфероидного анализа. Сокультурные сфероиды были произведены двумя прекурсорами сосудистых клеток человека, эндотелиальными колониями, образующими клетки (ECFCs) и мезенхимальными стволовыми клетками (MSC) с соотношением 5 к 1. Сфероиды ECFCs-MSCs были встроены в коллагеновую матрицу типа I для имитации внеклеточной среды in vivo. В режиме реального времени клеточный рекордер был использован для непрерывного наблюдения прогрессирования ангиогенного прорастания из сфероидов в течение 24 ч. Техника флуоресцентной маркировки живых клеток была также применена к тракту локализации каждого типа клеток во время образования ростков. Ангиогенный потенциал был количественно путем подсчета количества ростков и измерения кумулятивной длины ростков, генерируемых отдельными сфероидами. В экспериментальной группе было проанализировано пять случайно отобранных сфероидов. Сравнительные эксперименты показали, что сфероиды ECFCs-MSCs показали большее количество ростков и кумулятивную длину ростка по сравнению с сфероидами только ECFCs. Bevacizumab, FDA утвержденных ингибитор ангиогенеза, был протестирован с недавно разработанной совместной культуры сфероидной системы проверки, чтобы проверить его потенциал для проверки анти-ангиогенных препаратов. Значение IC50 для сфероидов ECFCs-MSCs по сравнению с сфероидами только ECFCs было ближе к эффективной концентрации плазмы bevacizumab, полученной из модели опухолевой мыши ксенотрансплантата. Настоящее исследование показывает, что 3D ECFCs-MSCs сфероидной ангиогенез системы асссея имеет отношение к физиологический ангиогенез, и может предсказать эффективную концентрацию плазмы до экспериментов на животных.
Introduction
Приблизительно 500 миллионов человек во всем мире, как ожидается, выиграют от ангиогенеза модуляции терапии для сосудистых пороков развития связанных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, окулопатия, сердечно-сосудистые заболевания, и метастаз опухоли1. Таким образом, разработка препаратов, контролирующих ангиогенез, стала важной областью исследований в фармацевтической промышленности. В процессе разработки препарата, in vivo исследования животных необходимо изучить влияние кандидатов наркотиков на физиологические функции и системные взаимодействия между органами. Тем не менее, этические и вопросы стоимости увеличили озабоченность в отношении экспериментов на животных2. Поэтому для получения более точных и предсказуемых данных, ведущих к лучшему принятию решений перед экспериментами на животных, необходимы усовершенствованные системы анализа in vitro. Текущие анализы in vitro ангиогенеза обычно измеряют пролиферацию, вторжение, миграцию или трубчатую структуру формирования эндотелиальных клеток (ECs), посеянных в двухмерных (2D) культурных пластинах3. Эти 2D ангиогенез анализы быстрый, простой, количественный, и экономически эффективным, и в значительной степени способствовали открытию ангиогенеза модулирующих препаратов. Однако ряд вопросов еще предстоит усовершенствовать.
Такие 2D системы анализа in vitro не могут отражать сложные многоступенчатые события ангиогенеза, который происходит в физиологических условиях vivo, что приводит к неточным результатам, которые вызывают расхождения между данными in vitro assay и результатами клинических испытаний4. 2D условия культуры также вызывают изменение клеточных фенотипов. Например, после распространения в 2D-культурных пластинах, ECs имеют слабый клеточный фенотип, проявляющийся снижением экспрессии CD34 и несколькими сигналами, которые регулируют клеточные ответы5,6. Для преодоления ограничений 2D-культурных систем анализа ангиогенеза были разработаны трехмерные (3D) сфероидные системы анализа ангиогенеза. Прорастание с последующим формированием трубчатой структуры из сфероидов, образованных ЭК, отражает в виво неоваскуляризации процессов7,8. Таким образом, 3D сфероид ангиогенез анализ считается эффективной системой ассеев для скрининга потенциальных про- или анти-ангиогенез наркотиков.
Большинство 3D сфероидных ангиогенез анализы использовать только ECs, в основном человеческие пупочные вены эндотелиальных клеток (HUVECs) или человека дермальных микрососудистых эндотелиальных клеток (HDMECs), чтобы сосредоточиться на клеточной реакции ЭК во время ангиогенеза. Однако капилляры крови состоят из двух типов клеток: ЭК и перицитов. Разработка двухнаправленного взаимодействия между ОР и перицитами имеет решающее значение для надлежащей целостности и функции сосудов. Некоторые заболевания, такие как наследственный инсульт, диабетическая ретинопатия и венозная мальформация, связаны с измененной плотностью перицитов или снижением перицита, прикрепленного к эндотелию9. Перициты также известны как ключевой элемент ангиогенного процесса. Перициты набираются для стабилизации вновь сформированных структур судна eCs. В связи с этим, моно-культура сфероид ангиогенез самосвидетельство не включает перициты7,10. Таким образом, сфероиды совместной культуры, образованные ЭК и перицитами, могут обеспечить ценный подход к более точно имитировать физиологические ангиогенные события.
Настоящее исследование направлено на разработку 3D-культуры сфероидного ангиогенеза анализ с сочетанием человека эндотелиальной колонии формирования клеток (ECFCs) и мезенхимальных стволовых клеток (MSCs), чтобы более тесно отражать в виво ангиогенеза. Кокультурная сфероидная система в качестве представления in vitro сборки нормального кровеносного сосуда была впервые создана Korff et al. в 2001году 11. Они объединили HUVECs и человеческие пупочные артерии гладкие мышечные клетки (HUSMCs), и показали, что совместная культура двух зрелых сосудистых клеток снижается потенциал прорастания. Зрелые ECs (HUVECs), как известно, постепенно теряют свою способность распространяться и дифференцировать, что негативно влияет на их ответы ангиогенеза12,13. Зрелые периваскулярные клетки (ГУСМК) могут вызвать инактивацию эндотелиальной клетки через отмену сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) отзывчивости11. Основное различие между системой Сфероидов Корфа и нашей совместной культуры заключается в используемых типах клеток. Мы применили два сосудистых прекурсора, ECFCs и MSCs, чтобы создать правильную систему асссирования ангиогенеза для проверки и исследования про-или-анти-ангиогенных агентов. ECFCs являются предшественником ECs. ECFCs имеют надежный потенциал распространения по сравнению со зрелыми ECs14, которые позволяют преодолеть ограничение ECs. ECFCs способствовать формированию новых судов во многих послеродовых патофизиологических условиях15,16,17. MSCs плюрипотентные стволовые клетки, которые имеют способность дифференцировать в перициты, тем самым способствуя ангиогенез18,19.
В предыдущих докладах, ECFCs и MSCs показали синергетический эффект на образование пробирки трубки20, in vivo неоваскуляризации21,22, и улучшение реперфузии ишемических тканей23,24. В настоящем исследовании, ECFCs и MSCs были использованы для формирования совместной культуры сфероидов и встроенных в тип I коллагена гель для отражения in vivo 3D окружающей среды. Коллаген считается одним из основных компонентов внеклеточной матрицы (ECM), окружающей ECs25. ECM играет важную роль в регулировании поведения клеток26. Предложенный здесь протокол анализа может быть легко и быстро осуществлен в течение двух дней с использованием общих лабораторных методов. Для эффективного отслеживания клеток в процессе прорастания, каждый тип клеток может быть флуоресцентно помечены и контролироваться с помощью записи клеток в режиме реального времени. Недавно созданная 3D-система анализов сфероидного ангиогенеза предназначена для повышения чувствительности к оценке потенциальных ангиогенных модуляторов и предоставления предсказуемой информации до исследования in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящее исследование ввести улучшенную систему анализа in vitro ангиогенеза с использованием сфероидов, образованных двумя человеческими сосудистыми клетками-прародителями, ECFCs и MSCs. осуществляется путем взаимодействия и включения между эндотелиальными клетками и перицитами. По срав…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом (17172MFDS215) от Министерства по безопасности пищевых продуктов и лекарственных средств, грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIP) (2017R1A2B4005463) и Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
- Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
- Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
- Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
- Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
- Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
- Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
- Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
- Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
- Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
- Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
- Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).
