Tredimensjonale angiogenese analysen system bruker co-kultur Spheroids dannet av endothelial Colony forming celler og Mesenchymal stamceller
Summary
Tredimensjonal co-kultur spheroid angiogenese analysen systemet er utformet for å etterligne den fysiologiske angiogenese. Co-kultur spheroids er dannet av to menneskelige vaskulære celle forløpere, ECFCs og MSCs, og innebygd i kollagen gel. Det nye systemet er effektivt for å evaluere angiogenic modulatorer, og gir mer relevant informasjon til in vivo studien.
Abstract
Studier innen angiogenese har vært aggressivt økende i de siste ti årene med erkjennelsen av at angiogenese er et kjennetegn på mer enn 50 ulike patologiske tilstander, slik som revmatoid artritt, oculopathy, hjerte-og karsykdommer , og tumor metastasering. Under angiogenese narkotika utvikling, er det avgjørende å bruke in vitro analysen systemer med aktuelle celletyper og riktige forhold for å gjenspeile fysiologiske angiogenese prosessen. For å overvinne begrensninger av gjeldende in vitro angiogenese analysen systemer ved hjelp av hovedsakelig endothelial celler, utviklet vi en 3-dimensjonal (3D) co-kultur spheroid spirende analysen system. Co-kultur spheroids ble produsert av to menneskelige vaskulær celle forløpere, endothelial koloni forming celler (ECFCs) og Mesenchymal stamceller (MSCs) med et forhold på 5 til 1. ECFCs + MSCs spheroids ble innebygd i type I kollagen matrise å etterligne in vivo ekstracellulære miljø. En sanntids celle opptaker ble benyttet for å kontinuerlig observere progresjon av angiogenic spirende fra spheroids for 24 h. live celle fluorescerende merkingsteknikker ble også brukt på tarmkanalen lokalisering av hver celle type under spire formasjon. Angiogenic potensiale ble kvantifisert ved å telle antall spirer og måle den kumulative lengden av spirer generert fra den enkelte spheroids. Fem tilfeldig valgte spheroids ble analysert per eksperimentell gruppe. Sammenligning eksperimenter viste at ECFCs + MSCs spheroids viste større spire tall og kumulativ spire lengde sammenlignet med ECFCs-bare spheroids. Bevacizumab, en FDA-godkjent angiogenese inhibitor, ble testet med den nylig utviklede co-kultur spheroid analysen system for å verifisere potensialet til skjermen anti-angiogenic narkotika. IC50 -verdien for ECFCs + MSCs-spheroids sammenlignet med ECFCs-Only-spheroids var nærmere den effektive plasmakonsentrasjonen av bevacizumab Hentet fra xenograft tumor musemodell. Den nåværende studien tyder på at 3D ECFCs + MSCs spheroid angiogenese analysesystem er relevant for fysiologiske angiogenese, og kan forutsi en effektiv Plasmakonsentrasjon i forkant av dyre eksperimenter.
Introduction
Ca 500 000 000 mennesker over hele verden er forventet å dra nytte av angiogenese-modulerende terapi for vaskulær misdannelse-assosiert sykdommer som revmatoid artritt, oculopathy, hjerte-og karsykdommer, og tumor metastasering1. Dermed har utviklingen av legemidler som kontrollerer angiogenese blitt et viktig forskningsområde i farmasøytisk industri. Under narkotika utviklingsprosessen er in vivo dyrestudier nødvendig for å undersøke virkningene av narkotika kandidater på fysiologiske funksjoner og systemiske interaksjoner mellom organene. Men etiske og kostnads spørsmål har økt bekymringene vedrørende dyre eksperimenter2. Derfor, forbedret in vitro analysen systemer er nødvendig for å oppnå mer nøyaktige og forutsigbare data som fører til bedre beslutningstaking før dyr eksperimenter. Current in vitro angiogenese analyser vanligvis måle spredning, invasjon, migrasjon, eller rørformede struktur dannelse av endothelial celler (ECs) seeded i to-dimensjonale (2D) kultur plater3. Disse 2D angiogenese analysene er raske, enkle, kvantitative og kostnadseffektive, og har i betydelig grad bidratt til oppdagelsen av angiogenese-modulerende narkotika. Men flere problemer gjenstår å bli bedre.
Slike 2D in vitro-analysen systemer kan ikke reflektere komplekse flertrinns hendelser av angiogenese som oppstår i in vivo fysiologiske forhold, fører til unøyaktige resultater som forårsaker avvik mellom in vitro-analysen data og klinisk utprøving utfall4. 2D kultur forhold også indusere endring av cellulære fenotyper. For eksempel, etter spredning i 2D kultur plater, ECs har en svak mobilnettet fenotype som manifestert ved redusert uttrykk for CD34 og flere signaler som regulerer cellulære responser5,6. For å overvinne begrensningene i 2D kultur-baserte angiogenese analysen systemer, tredimensjonale (3D) spheroid angiogenese analysen systemer har blitt utviklet. Spirende etterfulgt av rørformede struktur dannelse fra spheroids dannet av ECs reflektere in vivo neo-endometrial blodkar prosesser7,8. Dermed har 3D spheroid angiogenese analysen blitt betraktet som en effektiv analysen system for screening potensielle Pro-eller anti-angiogenese narkotika.
Høyst 3D spheroid angiogenese analyser anvende bare ECs, hovedsakelig Human navle vene endothelial celler (HUVECs) eller Human dermal mikrovaskulær endothelial celler (HDMECs) å fokusere mot det cellular svaret av ECs i løpet av angiogenese. Men blodkar består av to celletyper: ECs og pericytes. Utarbeide toveis interaksjon mellom ECs og pericytes er avgjørende for riktig vaskulær integritet og funksjon. Flere sykdommer, som arvelig slag, diabetiker retinopati, og venøs misdannelse, er assosiert med endret pericyte tetthet eller redusert pericyte vedlegg til endotelet9. Pericytes er også kjent som et nøkkelelement i angiogenic prosessen. Pericytes er rekruttert for å stabilisere nyopprettede fartøy strukturer av ECs. I denne forbindelse, mono-kultur spheroid angiogenese analysen ikke innlemme pericytes7,10. Derfor co-kultur spheroids dannet av ECs og pericytes kan gi en verdifull tilnærming til tettere etterligne fysiologiske angiogenic hendelser.
Den nåværende studien tok sikte på å utvikle en 3D co-kultur spheroid angiogenese analysen med en kombinasjon av menneskelig endothelial koloni forming celler (ECFCs) og Mesenchymal stamceller (MSCs) til nærmere reflektere in vivo angiogenese. Co-kultur spheroid system som en in vitro representasjon montering av en normal blodkar ble først etablert av korff et al. i 200111. De kombinerte HUVECs og menneskelige navle arterien glatte muskelceller (HUSMCs), og demonstrerte at co-kultur av to modne vaskulære celler redusert spirende potensialet. Eldre ECs (HUVECs) er kjent for å gradvis miste sin evne til å spre og differensiere, noe som negativt påvirker deres angiogenese svar12,13. Eldre inflammasjon celler (HUSMCs) kan forårsake endothelial celle deaktivering gjennom opphevelsen av vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) respons11. Den største forskjellen mellom korff ‘ s og vår co-kultur spheroid systemet er celle typene som brukes. Vi brukte to vaskulære forløpere, ECFCs og MSCs, å etablere en skikkelig angiogenese analysen system til skjermen og undersøke Pro-eller-anti-angiogenic agenter. ECFCs er forløperen til ECs. ECFCs har robust sprednings kapasitet sammenlignet med eldre ECs14, som gjør det mulig å overvinne begrensningen av ECS. ECFCs bidrar til nye fartøy dannelse i mange postnatal patofysiologisk forhold15,16,17. MSCs er Pluripotent stamceller som har kapasitet til å differensiere til pericytes, og dermed bidra til angiogenese18,19.
I tidligere rapporter, ECFCs og MSCs viste synergieffekter på in vitro tube formasjon20, in vivo neo-endometrial blodkar21,22, og forbedret reperfusion av iskemiske vev23,24. I denne studien, ECFCs og MSCs ble brukt til å danne co-kultur spheroids og innebygd i type I kollagen gel å reflektere en in vivo 3D miljø. Kollagen regnes som en stor bestanddeler av ekstracellulære matrise (ECM) rundt ECs25. ECM spiller en avgjørende rolle i å regulere celle atferden26. Analysen protokollen foreslås her kan enkelt og raskt utført innen to dager ved hjelp av vanlige laboratorie teknikker. For effektiv celle sporing under spirende prosessen, kan hver celle type bli fluorescensmerkete merket og overvåkes ved hjelp av en sanntids celle opptaker. Det ny-etablerte 3D tilpasse-kulturen spheroid angiogenese analysen system er beregnet på forhøye følsomheten for vurderer muligheter angiogenic modulatorer og å skaffe forutsigbar beskjed på forhånd av inne vivo studere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende studien introduserer en forbedret in vitro angiogenese analysen system utnytte co-kultur spheroids dannet av to menneskelige vaskulær celle forfedre, ECFCs og MSCs. co-kultur spheroid systemet kan etterligne in vivo vaskulær spire formasjon, som er oppnås ved samhandling og innlemmelse mellom endothelial celler og pericytes. Sammenlignet med andre in vitro angiogenese analyser som reflekterer bare ECs-mediert angiogenese, denne co-kultur analysen systemet er mer representativt for flertrinns kaskade av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av et stipend (17172MFDS215) fra departementet for mat og narkotika sikkerhet, National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea Government (MSIP) (2017R1A2B4005463), og Basic Science Research program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av utdanningsdepartementet (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
- Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
- Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
- Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
- Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
- Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
- Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
- Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
- Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
- Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
- Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
- Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).
