Tredimensionell Co-Culture sfäroid angiogenes assay system är utformat för att efterlikna fysiologisk angiogenes. Samkulturspheroids bildas av två humana vaskulära cellprekursorer, ECFCs och MSCs, och inbäddade i kollagen gel. Det nya systemet är effektivt för att utvärdera angiogena modulatorer, och ger mer relevant information till in vivo-studien.
Studier inom angiogenes har ökat aggressivt under de senaste decennierna med erkännandet att angiogenes är ett kännetecken för mer än 50 olika sjukdomstillstånd, såsom reumatoid artrit, oculopati, hjärt-kärlsjukdomar , och tumörmetastaser. Under angiogenes läkemedelsutveckling, det är viktigt att använda in vitro-analyssystem med lämpliga celltyper och korrekta villkor för att återspegla fysiologisk angiogenes processen. För att övervinna begränsningar av nuvarande in vitro angiogenesen assay system med främst endotelceller, utvecklade vi en 3-dimensionell (3D) Co-Culture sfäroid groning assay system. Samkulturspheroids producerades av två humana vaskulära cellprekursorer, endoteliala kolonibildande celler (ECFCs) och mesenkymala stamceller (MSCs) med ett förhållande på 5 till 1. ECFCs + MSCs spheroids var inbäddade i typ I kollagen matris för att efterlikna den in vivo extracellulära miljön. En realtid cell Recorder utnyttjades för att kontinuerligt Observera utvecklingen av angiogena groning från spheroids för 24 h. levande cell fluorescerande märkning teknik tillämpades också för att tarmkanalen lokalisering av varje celltyp under spira bildas. Angiogen potential kvantifierades genom att räkna antalet groddar och mäta den kumulativa längden av groddar som genereras från de enskilda spheroids. Fem slumpmässigt utvalda spheroids analyserades per experimentell grupp. Jämförelse experiment visade att ECFCs + MSCs spheroids visade större spira och kumulativ spira längd jämfört med ECFCs-bara spheroids. Bevacizumab, en FDA-godkänd angiogeneshämmare, testades med den nyutvecklade Co-Culture sfäroid assay system för att kontrollera dess potential att avskärma antiangiogena läkemedel. IC50 värde för ecfcs + MSCS spheroids jämfört med ecfcs-bara spheroids var närmare den effektiva plasmakoncentrationen av bevacizumab erhållits från xenograft tumör musmodell. Den nuvarande studien tyder på att 3D ecfcs + MSCS sfäroid angiogenes assay system är relevant för fysiologisk angiogenes, och kan förutsäga en effektiv plasmakoncentration i förväg av djurförsök.
Cirka 500 000 000 personer världen över förväntas dra nytta av angiogenes-modulerande terapi för vaskulär missbildning-associerade sjukdomar såsom reumatoid artrit, oculopathy, hjärt-kärlsjukdomar, och tumörmetastaser1. Således har utvecklingen av läkemedel som styr angiogenes blivit ett viktigt forskningsområde inom läkemedelsindustrin. Under läkemedelsutveckling, in vivo Djurstudier är nödvändigt att undersöka effekterna av läkemedelskandidater på fysiologiska funktioner och systemiska interaktioner mellan organ. Men etiska och kostnadsfrågor har ökat oron när det gäller djurförsök2. Därför behövs förbättrade in vitro-analyssystem för att få mer exakta och förutsägbara data som leder till bättre beslutsfattande innan djurförsök. Nuvarande in vitro angiogeneshassays mäter vanligtvis proliferation, invasion, migration, eller tubulär struktur bildning av endotelceller (ECs) seedade i tvådimensionella (2D) kultur tallrikar3. Dessa 2D angiogenes analyser är snabba, enkla, kvantitativa och kostnadseffektiva, och har avsevärt bidragit till upptäckten av angiogenes-modulerande läkemedel. Flera frågor återstår dock att förbättra.
Sådana 2D in vitro-analyssystem kan inte återspegla komplexa flerstegshändelser av angiogenes som uppträder i in vivo fysiologiska tillstånd, vilket leder till felaktiga resultat som orsakar avvikelser mellan in vitro-analysdata och resultat från kliniska prövningar4. 2D odlingsförhållanden inducerar också förändringen av cellulära fenotyper. Till exempel, efter spridning i 2D kultur plattor, ECs har en svag cellulär fenotyp som manifesteras genom minskat uttryck av CD34 och flera signaler som reglerar cellulära svar5,6. För att övervinna begränsningarna i 2D-kulturbaserade angiogeneshämmare system, har tredimensionella (3D) sfäroid angiogenes analyssystem utvecklats. Sprouting följt av tubulär struktur formation från spheroids bildas av ECs reflektera in vivo Neo-vascularization processer7,8. Sålunda, den 3D sfäroid angiogenes analysen har ansetts vara ett effektivt analyssystem för screening potentiella Pro-eller anti-angiogenes läkemedel.
De flesta 3D sfäroid angiogenes analyser utnyttjar endast ECs, främst mänskliga navel venen endotelceller (HUVECs) eller Human dermal mikrovaskulära endotelceller (HDMECs) att fokusera på cellulär respons av ECs under angiogenes. Emellertid, blod kapillärer består av två celltyper: ECs och pericyter. Att utveckla dubbelriktad interaktion mellan ECs och pericyter är avgörande för korrekt vaskulär integritet och funktion. Flera sjukdomar, såsom ärftlig stroke, diabetesretinopati, och venös missbildning, är förknippade med förändrade pericytbiologi densitet eller minskade pericytbiologi fastsättning till endotelet9. Pericyter är också känd som en viktig del av angiogena processen. Pericyter rekryteras för att stabilisera nybildade fartygs strukturer av ECs. I detta avseende, mono-kultur sfäroid angiogenes analysen inte innehåller pericyter7,10. Därför kan Co-Culture spheroids bildas av ECs och pericyter ge en värdefull metod för att närmare efterlikna fysiologiska angiogena händelser.
Den nuvarande studien syftade till att utveckla en 3D-Co-kultur sfäroid angiogenicitetsanalys med en kombination av humana endoteliala kolonibildande celler (ecfcs) och mesenkymala stamceller (MSCS) för att närmare reflektera in vivo angiogenes. Co-Culture sfäroid system som en in vitro-representation församling av ett normalt blodkärl fastställdes först av Korff et al. i 200111. De kombinerade huvecs och mänskliga navel Strängs glatta muskelceller (husmcs), och visade att samodling av två mogna vaskulära celler minskade groning potential. Mogna ECs (huvecs) är kända för att successivt förlora sin förmåga att förgöra och differentiera, vilket negativt påverkar deras angiogenes svar12,13. Mogna perivaskulära celler (husmcs) kan orsaka endotelceller cell inaktivering genom upphävande av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) lyhördhet11. Den största skillnaden mellan korffs och vår co-Culture sfäroid system är de celltyper som används. Vi tillämpade två vaskulära prekursorer, ECFCs och MSCs, att etablera en ordentlig angiogenes assay system för att avskärma och undersöka Pro-eller-antiangiogena medel. ECFCs är föregångaren till ECs. ECFCs har robust spridnings kapacitet jämfört med mature ECs14, vilket gör det möjligt att övervinna begränsningen av ECS. Ecfcs bidrar till ny fartygs bildning i många postnatal patofysiologiska tillstånd15,16,17. MSCS är pluripotenta stamceller som har förmågan att differentiera till pericyter, vilket bidrar till angiogenes18,19.
I tidigare rapporter, ecfcs och MSCS visade synergistiska effekter på in vitro-rör bildas20, in vivo Neo-vascularization21,22, och förbättrad reperfusion av ischemiska vävnader23,24. I den nuvarande studien användes ECFCs och MSCs för att bilda samkulturspheroider och bäddas in i typ I kollagen gel för att återspegla en in vivo 3D-miljö. Kollagen betraktas som en viktig beståndsdel i den extracellulära matrisen (ECM) kring ECs25. ECM spelar en kritisk roll i regleringen av cellens beteende26. Det analysprotokoll som föreslås här kan enkelt och snabbt utföras inom två dagar med hjälp av vanliga laboratorietekniker. För effektiv cell spårning under groning-processen kan varje celltyp fluorescerande märkas och övervakas med hjälp av en realtids cells inspelare. Den nyinrättade 3D Co-Culture sfäroid angiogenes assay system är utformat för att öka känsligheten för att utvärdera potentiella angiogena modulatorer och att ge förutsägbar information i förväg i in vivo studie.
Den nuvarande studien införa en förbättrad in vitro angiogenes assay system som utnyttjar Co-Culture spheroids bildas av två mänskliga vaskulär cell progenitorer, ecfcs och MSCS. co-Culture sfäroid system kan efterlikna in vivo vaskulär spira bildas, vilket är åstadkommas genom interaktion och inkorporering mellan endotelceller och pericyter. Jämfört med andra in vitro-analyser av angiogenes som endast återspeglar ECs-medierad angiogenes är detta Co-Culture-analyssystem mer representativt för i flera steg-…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av ett bidrag (17172MFDS215) från ministeriet för livsmedels-och läkemedels säkerhet, National Research Foundation of Korea (NRF) Grant finansieras av Koreas regering (MSIP) (2017R1A2B4005463), och det grundläggande forskningsprogrammet genom National Research Foundation of Korea (NRF) finansierat av undervisningsministeriet (2016R1A6A1A03007648).
0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |