Метод изучения де Ново Формирование хрометинов доменов
Summary
Этот метод предназначен для последующего формирования PRC2-опосредованных доменов хроматина в клеточных линиях, и метод может быть адаптирован ко многим другим системам.
Abstract
Организация и структура доменов хроматина уникальны для отдельных клеточных линий. Их неправильное регулирование может привести к потере клеточной идентичности и/или болезни. Несмотря на огромные усилия, наше понимание формирования и распространения хроматина по-прежнему ограничено. Хроматин домены были изучены в условиях стабильного состояния, которые не способствуют после первоначальных событий во время их создания. Здесь мы представляем метод индуцирования хроматинов доменов и следовать их реформированию как функции времени. Хотя, сперва приложенное к случаю PRC2-опосредованного репрессивного образования домена chromatin, оно смогло легко быть приспособлено к другим доменам хроматина. Модификация и/или сочетание этого метода с геномикой и технологиями визуализации предоставит бесценные инструменты для детального изучения создания доменов хроматина. Мы считаем, что этот метод произведет революцию в нашем понимании того, как хроматины образуют и взаимодействуют друг с другом.
Introduction
Эукариотические геномы хорошо организованы и изменения в доступностихроматина непосредственно контролируют транскрипцию генов 1. Геном содержит различные типы хроматиновых доменов, которые коррелируют с транскрипционной активностью и сроками репликации2,3. Эти хроматиндометы варьируются в размерах от нескольких килобаз (кб) до более чем 100 кб и характеризуются обогащением в различных модификациях гистона4. Главные вопросы: как формируются эти области и как они распространяются?
Один из наиболее хорошо охарактеризованных хроматина доменов поощряется через деятельность Поликомб репрессивного комплекса 2 (КНР2). КНР2 представляет собой многофункциональный комплекс, состоящий из подмножества Polycomb Group (PcG) белков5,6, и катализирует моно-, ди- и триметилирование лизина 27 гистон H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 связаны с репрессивным состоянием хроматина, но функция H3K27me1 неясна6,11. Один из основных компонентов PRC2, эмбрионального развития эктодерма (EED), связывает с конечным продуктом PRC2 катализ, H3K27me3, через его ароматические клетки, и эта функция приводит к аллостерической стимуляции PRC212,13. Ферментативная активность КНР2 имеет решающее значение для сохранения клеточной идентичности во время развития, так какнеуместное выражение определенных генов развития, которые противопоказаны для определенной линии, было бы пагубным 5,6 . Таким образом, распутывание механизмов, с помощью которых КНР2 способствует формированию репрессивных хроматинов у млекопитающих имеет основополагающее значение для понимания клеточной идентичности.
Все прошлые экспериментальные системы, предназначенные для исследования образования доменов хроматина, включая PRC2-опосредованные домены хроматина, были выполнены в условиях устойчивого состояния, которые не в состоянии отслеживать разворачивающиеся события образования доменов хроматина в Клетки. Здесь мы представляем подробный протокол для создания индуцируемой клеточной системы, которая отслеживает первоначальный набор и распространение хроматина доменов. В частности, мы фокусируемся на отслеживании формирования PRC2-опосредованных репрессивных доменов хроматина, которые составляют H3K27me2/3. Эта система, которая может захватить механистические детали образования доменов хроматина, может быть адаптирована для включения других областей хроматина, таких как широко изученные домены, включающие либо H2AK119ub или H3K9me. В сочетании с геномикой и технологиями визуализации, этот подход имеет потенциал для успешного решения различных, ключевых вопросов в биологии хроматина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мощный подход к пониманию механистических деталей во время формирования данного домена хроматина, заключается в том, чтобы сначала нарушить домен, а затем отслеживать его реконструкцию в клетках. Процесс может быть приостановлен в любое время во время реконструкции, чтобы детально пр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Л. Валеса, Д. Озата и Х. Моу за пересмотр рукописи. D.R. Lab поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза и Национальными институтами здравоохранения (R01CA199652 и R01NS100897).
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
- Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
- Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
- Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
- Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
- Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
- Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
- Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
- Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
- Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
- Benchling for Academics. Benchling Available from: https://benchling.com (2018)
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
- Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- . UCSC Genome Browser Home Available from: https://genome.ucsc.edu (2019)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
- Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).
