干细胞衍生病毒Ag特异性T淋巴细胞抑制小鼠HBV复制
Summary
这里介绍了一个协议，通过利用干细胞衍生病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞的采用细胞转移（ACT），有效抑制小鼠乙型肝炎病毒（HBV）复制。这个程序可以适应潜在的基于ACT的HBV感染免疫治疗。
Abstract
乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个全球性的健康问题。全世界有超过3.5亿人感染乙肝病毒，乙肝病毒感染仍然是肝癌的主要原因。这是一个重大关切，特别是在发展中国家。免疫系统未能对乙肝病毒进行有效反应，导致慢性感染。虽然乙肝疫苗存在，新的抗病毒药物正在研制中，但消灭病毒储存细胞仍然是一个主要的健康主题。本文介绍的一种用于生成病毒抗原 （Ag） – 特异性 CD8–细胞毒性 T 淋巴细胞 （CTLs） 的方法，该细胞来自诱导多能干细胞 （iPSC）（即 iPSC-CTLs），能够抑制 HBV 复制。通过将HBV表达质粒（pAAV/HBV1.2）水动力注射到肝脏，在小鼠中有效诱导HBV复制。然后，HBV表面Ag特异性小鼠iPSC-CTLs被采用转移，这极大地抑制了乙肝病毒在肝脏和血液中的复制，并防止了肝细胞中HBV表面Ag表达。该方法在水动力注射后证明小鼠HBV复制，干细胞衍生的病毒Ag特异性CTL可以抑制HBV复制。该协议为HBV免疫治疗提供了一种有用的方法。
Introduction
急性感染后，适应性免疫系统（即体液和细胞免疫）控制与HBV相关的急性肝炎的大部分。然而，在乙肝病毒流行地区的一些人无法消除病毒，随后转化为慢性个体。全球超过25%的慢性病患者（超过2.5亿人）发展为渐进性肝病，导致肝硬化和/或肝细胞癌（HCC）1。因此，尽管现有疫苗2和许多抗病毒药物正在研制中，但根除持续感染的细胞仍然是一个普遍的健康问题。HBV感染的标准治疗包括IFN-α、核苷和核苷酸类似物。这些制剂具有直接的抗病毒活性和免疫调节能力。然而，HBe抗原（Ag）的血清转化+具有抗HBe抗体（Ab）的载体和血清HBV脱氧核糖核酸（DNA）的流失在大约20%的治疗患者中单独出现，病毒的整个免疫控制经核实，HBsAg的剥夺不超过5%3。此外，对治疗的反应往往不持久。使用重组HBs Ag进行预防性疫苗接种在预防感染方面非常有效，但治疗性HBs Ag疫苗接种无效。显然，T细胞介导的免疫反应在控制HBV感染和肝损伤方面起着关键作用;然而，在慢性肝炎患者中，HBV反应性T细胞经常被删除、功能失调或转换耗尽4，5，6。因此，在持续性乙肝病毒感染者中，没有试图通过抗病毒疗法、免疫调节细胞因子或治疗性免疫恢复HBV特异性免疫（即T细胞基免疫）的努力取得了成功。
HBV AG特异性T细胞的收养细胞转移（ACT）是一种有效的治疗方法，旨在最终根除剩余的肝细胞wih HBV7，8。HBV特异性CTP在HBV感染小鼠中已被证明会导致暂时性、轻度肝炎，肝细胞核糖核酸（RNA）转录本的显著下降。在这些研究中，CTL没有抑制HBV基因的转录，但提高了HBV转录9的降解。HBV特异性CTL对预防病毒感染和调解HBV10、11的清除非常重要。对于基于ACT的补救措施，HBV特异性T细胞在体外扩张，具有高反应性，用于体内再定居，建议其为理想的方法12、13、14;然而，目前的方法在产生、分离和从患者身上产生、分离和生长适当数量的HBV特异性T细胞的能力方面受到限制，以进行潜在的治疗。
尽管临床试验通过针对受HBV病毒感染的肝细胞的工程T细胞提供细胞治疗的安全性、实用性和前瞻性治疗活性，但人们担心这种不良影响由于错误配对T细胞受体（TCR）15、16、非特异性TCR17的离目标Ag识别和由嵌合Ag受体（CAR）对靶向脱毒性的交叉反应，自体免疫反应发生18,19与健康组织。目前，转基因T细胞，只有短期的持久性在体内，通常是中间或后期效应T细胞。迄今为止，多能干细胞（PSCs）是唯一可用于产生大量天真的单型Ag特异性T细胞20、21、22、23的来源。诱导PSCs（iPSCs）通过使用多个转录因子的基因转导，从患者的体细胞中转换。因此，iPSC具有与胚胎干细胞（ESCs）24相似的特性。由于具有无限自我更新能力的灵活性和可能性，除了组织替代外，基于iPSC的治疗可以广泛应用于再生医学。此外，iPSC的底层军团可能会显著改善目前的基于细胞的疗法。
该方法的总体目标是从 iPSC（即 iPSC-CTL）生成大量 HBV 特异性 CTL，用于基于 ACT 的免疫治疗。与替代技术的优点是，HBV 特异性 iPSC-CTL 具有单型 TCR 和天真的表型，这导致在 ACT 之后产生更多的记忆 T 细胞发育。证明HBV特异性iPSC-CTL的ACT可增加肝功能CD8+T细胞的迁移，减少被管理小鼠肝脏和血液中的HBV复制。这种方法揭示了病毒Ag特异性iPSC-CTLs在HBV免疫治疗中的潜在用途，并可能用于生成用于病毒免疫治疗的其他病毒Ag特异性iPSC-T细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议提供了一种生成病毒性Ag特异性iPSC-CTLs的方法，用作ACT，以抑制小鼠模型中的HBV复制。在慢性HBV感染中，病毒基因组形成一个稳定的迷你染色体，即共价闭合的圆形DNA（cccDNA），可以在整个肝细胞的生命周期内持续。靶向病毒小染色体的清除可能导致慢性HBV感染的治愈。目前的抗病毒治疗针对病毒逆转录酶，但很少建立由cccDNA驱动的HBV复制的免疫控制。HBV 特异性 CD8– CTL 可以调解?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢多伦多总医院研究所的Adam J Gehring博士为HBs183-91（S183）（FLLTRILTI）提供cDNA-特定A2限制人-鼠杂交TCR基因，以及台湾国立大学的陈佩杰博士提供pAAV/HBV 1.2 结构。这项工作得到国家卫生补助机构R01AI121180、R01CA221867和R21AI109239到J.S的支持。
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
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