Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones
Summary
Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.
Abstract
La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es un problema de salud mundial. Con más de 350 millones de personas afectadas en todo el mundo, la infección por el VHB sigue siendo la principal causa de cáncer de hígado. Esta es una preocupación importante, especialmente en los países en desarrollo. La falta de montaje del sistema inmunitario contra el VHB conduce a una infección crónica. Aunque la vacuna contra el VHB está presente y se están creando nuevos medicamentos antivirales, la erradicación de las células de los reservorios de virus sigue siendo un tema de salud importante. Aquí se describe un método para la generación de antígeno viral (Ag) -cd8 específico+ linfocitos T citotóxicos (CTL) derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) (es decir, iPSC-CTL), que tienen la capacidad de suprimir la replicación del VHB. La replicación del VHB se induce eficientemente en ratones a través de la inyección hidrodinámica de un plásmido de expresión de VHB, pAAV/HBV1.2, en el hígado. A continuación, los iPSC-CTL de ratón específicos de La superficie del VHB se transfieren de forma adoptiva, lo que suprime en gran medida la replicación del VHB en el hígado y la sangre, así como previene la expresión Ag de la superficie del VHB en los hepatocitos. Este método demuestra la replicación del VHB en ratones después de la inyección hidrodinámica y que los CTL virales específicos de Ag derivados de células madre pueden suprimir la replicación del VHB. Este protocolo proporciona un método útil para la inmunoterapia con VHB.
Introduction
Después de una infección aguda, el sistema inmunitario adaptativo (es decir, inmunidad humoral y celular) controla la mayor parte de la hepatitis aguda relacionada con el VHB. Sin embargo, varias personas en las regiones endémicas del VHB no pueden eliminar los virus y posteriormente convertirse como individuos crónicos. Más del 25% de los pacientes crónicos (>250 millones de personas) en todo el mundo desarrollan enfermedad hepática progresiva, lo que resulta en cirrosis hepática y/o carcinoma hepatocelular (HCC)1. Como resultado, la erradicación de las células infectadas insistentemente sigue siendo un problema general de salud, a pesar de que hay una vacuna disponible2 y numerosos medicamentos antivirales están en desarrollo. El tratamiento estándar para la infección por VHB incluye análogos de IFN, nucleósidos y nucleótidos. Estos agentes tienen actividad antiviral directa y capacidades moduladoras inmunes. Sin embargo, la seroconversión del antígeno HBe (Ag)+ portadores con anticuerpo anti-HBe (Ab) y pérdida de ácido desoxirribonucleico sérico del VHB (ADN) aparecen individualmente en aproximadamente el 20% de los pacientes tratados, y el control inmunológico completo del virus verificada por la privación del HBsAg no es más del 5%3. Además, la respuesta al tratamiento a menudo no es duradera. La vacunación profiláctica con HBs Ag recombinante es altamente eficaz en la prevención de infecciones, pero la vacunación terapéutica de HBs Ag no es eficaz. Claramente, las respuestas inmunitarias mediadas por células T desempeñan un papel crítico en el control de la infección por el VHB y la insuficiencia hepática; sin embargo, en pacientes crónicos con hepatitis, los thbv reactivos a menudo se eliminan, disfuncionales o conviertenagotado4,5,6. En consecuencia, en individuos con infección persistente por VHB, no se ha logrado el éxito de ningún intento de restablecer la inmunidad específica del VHB (es decir, la inmunidad basada en células T) mediante remedio antiviral, citoquinas inmunomoduladoras o inmunización curativa.
La transferencia celular adoptiva (ACT) de células T específicas del VHB Ag es un tratamiento eficiente dirigido a erradicar eventualmente los hepatocitos restantes con el VHB7,8. Se ha demostrado que el ACT de CTL específicos del VHB en ratones infectados por el VHB causa hepatitis leve transitoria y, y una disminución dramática de las transcripciones del ácido ribonucleico del VHB (ARN) en los hepatocitos. En estos estudios, los CTL no inhibiron la transcripción de genes del VHB, sino que mejoraron la degradación de las transcripciones del VHB9. Los CTL específicos del VHB son importantes para prevenir la infección viral y mediar en el aclaramiento del VHB10,11. Para los remedios basados en ACT, se ha sugerido que la expansión in vitro de células T específicas del VHB con una alta reactividad para el reasentamiento in vivo es un método ideal12,13,14; sin embargo, los enfoques actuales están restringidos con respecto a sus capacidades para generar, separar y crecer cantidades y cualidades apropiadas de células T específicas del VHB de los pacientes para las terapias potenciales.
Aunque los ensayos clínicos presentan seguridad, practicabilidad y actividad terapéutica prospectiva de tratamientos basados en células mediante células T de ingeniería que son específicos de los hepatocitos infectados por el virus del VHB, hay preocupaciones sobre los efectos desfavorables debido a las respuestas autoinmunes debido a la reactividad cruzada del receptor de células T de búsqueda incorrecta (TCR)15,16, reconocimiento Ag fuera del objetivo por TCR no específico17 y fuera de toxicidad en el objetivo por un receptor Ag quimérico (CAR) 18 , 19 con tejidos sanos. Actualmente, las células T modificadas genéticamente, que sólo tienen persistencia a corto plazo in vivo, son generalmente células T intermedias o posteriores. Hasta la fecha, las células madre pluripotentes (PSC) son la única fuente disponible para generar un gran número de células T nave de tipo único Ag20,21,22,23. Los PsC inducidos (iPSC) simplemente se convierten a partir de las células somáticas de un paciente mediante el uso de la transducción génica de varios factores de transcripción. Como resultado, los iPSC tienen características similares a las de las células madre embrionarias (ESC)24. Debido a la flexibilidad y la posibilidad de la capacidad infinita de auto-renovarse, además de la sustitución de tejidos, los tratamientos basados en iPSC pueden aplicarse ampliamente en la medicina regenerativa. Además, los regimientos subyacentes a las iPSC pueden mejorar sustancialmente las terapias actuales basadas en células.
El objetivo general de este método es generar una gran cantidad de CTL específicos del VHB a partir de iPSC (es decir, iPSC-CTLs) para la inmunoterapia basada en ACT. Las ventajas sobre las técnicas alternativas son que los iPSC-CTL específicos del VHB tienen un tCR de un solo tipo y un fenotipo ingenuo, lo que da como resultado un mayor desarrollo de células T de memoria después del ACT. Se ha demostrado que el ACT de iPSC-CTL específicos del VHB aumenta la migración de células CD8+ T funcionales en el hígado y reduce la replicación del VHB tanto en el hígado como en la sangre de los ratones administrados. Este método revela un uso potencial de iPSC-CTL virales específicos de Ag para la inmunoterapia con VHB y puede adaptarse para generar otras células iPSC-T virales específicas de Ag para inmunoterapia viral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta un método para generar los iPSC-CTL virales específicos de Ag para su uso como ACT para suprimir la replicación del VHB en un modelo murino. En la infección crónica por el VHB, el genoma viral forma un minicromo estable, el ADN circular covalentemente cerrado (CCCDNA) que puede persistir a lo largo de la vida útil del hepatocito. Dirigirse al aclaramiento del mini cromosoma viral puede dar lugar a una cura de la infección crónica por el VHB. La terapia antiviral actual se dirige al virus a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Adam J Gehring del Instituto de Investigación del Hospital General de Toronto por proporcionar ADNc para HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)- genes TCR híbridos humano-murinos específicos restringidos en A2, y el Dr. Pei-Jer Chen de la Universidad Nacional de Taiwán para proporcionar construcción pAAV/HBV 1.2. Este trabajo es apoyado por el Instituto Nacional de Salud Grant R01AI121180, R01CA221867 y R21AI109239 a J. S.
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
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