שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs
Summary
אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 ‘-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.
Abstract
המחקר של RNAs קטן (sRNAs) לפי רצף הדור הבא (NGS) הוא מאותגר על ידי בעיות הטיה במהלך הכנת הספרייה. מספר סוגים של sRNA כגון צמח microRNAs (miRNAs) לשאת 2 ‘-O-מתיל (2 ‘-OMe) שינוי ב 3 ‘ מסופים שלהם שלהם. שינוי זה מוסיף קושי נוסף כאשר הוא מעכב את החיבור של 3 מתאמים. בעבר הדגמנו שלגירסאות ששונו של פרוטוקול TruSeq (TS) יש פחות הטיה וזיהוי משופר של 2 ‘ מוכן ‘. כאן אנו מתארים בפרוטוקול פירוט ‘ TS5 ‘, אשר הראה את הביצועים הכוללים הטוב ביותר. TS5 ניתן לעקוב גם באמצעות ריאגנטים תוצרת בית או ריאגנטים מערכת TS, עם ביצועים שווים.
Introduction
RNAs קטנים (sRNAs) מעורבים בשליטה של מגוון תהליכים ביולוגיים1. התקנות הרגולטוריות של eukaryotic הן בדרך כלל בין 20 ל-30 nt; שלושת הסוגים העיקריים הם microRNAs (miRNA), piwi-אינטראקציה RNAs (piRNA) ו-RNAs מתערב קטן (siRNA). רמות הביטוי המוטעות היו מעורבים במגוון מחלות2. זה מדגיש את החשיבות של miRNAs בריאות ומחלות והדרישה לכלי מחקר מדויקים, כמותיים כדי לזהות sRNAs בכלל.
רצף הדור הבא (NGS) הוא שיטה נפוצה ללימוד sRNAs. היתרונות העיקריים של ngs לעומת גישות אחרות, כגון ה-PCR כמותי או טכניקות microarray (qpcr), הם שהוא אינו זקוק לידע פריורי של רצפי srna ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לגלות rnas הרומן, ובנוסף הוא סובל פחות מ אותות רקע ואפקטי רוויה. עוד, הוא יכול לזהות הבדלים נוקלאוטיד יחיד ויש לו תפוקה גבוהה יותר מאשר מיקרו מערכים. עם זאת, NGS יש גם כמה החסרונות; העלות של הפעלה ברצף נותרת גבוהה יחסית ותהליך רב הנדרש כדי להמיר מדגם לספריה לרצף עשוי להציג הטיות. בתהליך ההכנה האופייני של ספריית srna, מתאם 3 מגיע לראשונה ל-srna (לעתים קרובות ג’ל מזוקק מ-rna הכולל) בגרסה קטומה של rna ליגאז 2 (RNL2) ומתאם 3 מקדים (איור 1) בהיעדר ATP. הדבר מגביר את היעילות של הקשר המתאם של sRNA ומפחית את היווצרות התגובות הצדדיות כדוגמת sRNA circularization או קונקטאריזציה. לאחר מכן, 5 ‘ מתאם הוא ליגיום על ידי RNA ליגאז 1 (RNL1), ואחריו תמלול הפוכה (RT) ו-PCR הגברה. כל השלבים הללו עשויים להציג הטיה3,4. כתוצאה מכך, קריאת מספרים עשויה שלא לשקף רמות ביטוי בפועל של sRNA המובילות לתבניות ביטוי מלאכותיות התלויות בשיטה. SRNAs ספציפיים עשוי להיות מוגדר או לא מיוצג בספריה, ומאוד מיוצגת על-ידי sRNAs שעשוי להימלט מזיהוי. המצב מורכב במיוחד עם mirnas צמחים, sirnas בחרקים וצמחים, ו pirnas בחרקים, נמטודות ויונקים, שבו 3 ‘ מסוף נוקלאוטיד יש 2 ‘-O-מתיל (2 ‘-OMe) שינוי1. שינוי זה מעכב בחוזקה 3 ‘ מתאם התאמה5, ביצוע הכנה ספריה עבור סוגים אלה של RNA משימה קשה.
העבודה הקודמת הוכיחה שלקשר מתאם מציג הטיה רצינית, עקב השפעות רצף/מבנה RNA6,7,8,9,10,11. מדרגות במורד הזרם של המתאם כגון תעתיק הפוך ו-PCR לא תורמים באופן משמעותי להטיה6,11,12. הטיה ליפטיים היא כנראה בשל העובדה כי מולקולות מתאם עם רצף נתון יהיה אינטראקציה עם מולקולות sRNA בתערובת התגובה לטופס מקפלים שכונתיות, כי יכול להוביל תצורות חיוביות או שלילי לצורך הארכה (איור 2). נתונים מsorefan ואח ‘7 מראים כי RNL1 מעדיף הקשר נטוש יחיד, בעוד RNL2 מעדיף סטרנד כפול לצורך הארכה. העובדה שמבני הקיפול המשותף של המתאם/sRNA נקבעים על-ידי המתאם הספציפי ורצפי sRNA מסביר מדוע sRNA ספציפי מיוצג באמצעות ערכת מתאם נתונה. חשוב גם לציין שבתוך סדרה של ספריות sRNA שיש להשוותו, יש להשתמש באותם רצפי מתאמים. אכן, זה בעבר נצפתה כי שינוי מתאמים על ידי המבוא של רצפי ברקוד שונים משנה את פרופילי mirna ב רצף ספריות9,13.
אקראיות של רצפי מתאמים ליד צומת החיבור עלולה להקטין את הביסים האלה. Sorefan ועמיתיו7 מתאמים משומשים עם 4 נוקלאוטידים אקראיים בגפיים שלהם, המיועדים “high Definition” (HD) מתאמים, והראו כי השימוש במתאמים אלה מוביל לספריות שמשקפות טוב יותר את רמות הביטוי srna אמיתי. עבודה עדכנית יותר אישרה תצפיות אלה וחשף כי האזור האקראי אינו צריך להיות סמוך לצומת החיבור11. סוג זה של המתאמים נקרא “MidRand” מתאמים. יחד, תוצאות אלה מדגימות כי עיצוב מתאם משופר יכול להפחית את ההטיה.
במקום לשנות את המתאמים, הטיה ניתן לדכא דרך האופטימיזציה של תנאי התגובה. פוליאתילן גליקול (יתד), סוכן macromolecular צפיפות הידוע כדי להגדיל את יעילות לקצץ14, הוכח להפחית באופן משמעותי הטיה15,16. מבוסס על תוצאות אלה, כמה “נמוך הטיה” ערכות הופיעו בשוק. אלה כוללים ערכות המשתמשות ב-יתד בתגובות הקשר, או בשילוב עם מתאמים קלאסיים או מתאמי HD. ערכות אחרות להימנע לחלוטין, ולהשתמש 3 ‘ פוליאדלציה ומיתוג תבנית עבור 3 ‘ ו 5 ‘ מתאם התוספת, בהתאמה12. בעוד אסטרטגיה אחרת, הארכה של 3 מתאמים מלווה בצעד מעגלי, ובכך משמיט את החוגה של 5 מתאמים17.
במחקר קודם חיפשנו פרוטוקול הכנה של ספריית sRNA עם הרמות הנמוכות ביותר של הטיה ואת הזיהוי הטוב ביותר של 2 ‘-OMe RNAs12. בדקנו כמה מהעירייה ‘ הטיה נמוכה ‘ ערכות, אשר היה זיהוי טוב יותר של 2 ‘-OMe RNAs מאשר פרוטוקול רגיל (TS). באופן מפתיע עם זאת, עם השינוי (השימוש של מתאמים אקראיים, פג בתגובות לתיקון והסרה של עודף 3 ‘ מתאם על ידי טיהור) האחרון ביצע את הפרוטוקולים האחרים לאיתור של 2 ‘-OMe RNAs. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול מבוסס על פרוטוקול TS, ‘ TS5 ‘, אשר היה הזיהוי הכללי הטוב ביותר של 2 ‘-כולל RNAs. הפרוטוקול יכול להיות בעקבות באמצעות ריאגנטים מערכת ה-TS ומגיב אחד מן הקיט ‘ Nf ‘ או, כדי לחסוך כסף, באמצעות ריאגנטים תוצרת בית, עם ביצועים שווים. אנו מספקים גם פרוטוקול מפורט לטיהור של sRNA מ-RNA הכולל והכנת מתאם 3 מראש.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנה קטנה של ספריית RNA נותרת מאתגרת עקב הטיה, שהוצגה בעיקר במהלך שלבים להטיות במתאם. Rnas עם 2 ‘-OMe שינוי ב 3 ‘ סוף שלהם כגון צמח mirnas, pirna חרקים, נמטודות ויונקים, ו rnas מתערב קטן (sirna) חרקים וצמחים הם קשים במיוחד ללמוד כי 2 ‘-OMe שינוי מעכב 3 ‘ מתאם הקשר. מספר פתרונות הוצעו בספרות כדי לשפר את פרוטוקולי ההכנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS), האנרגיות החלופיות הצרפתיות והנציבות לאנרגיה אטומית ואוניברסיטת פריס-Sud. כל הכנות הספריה, המאייר רצף וביואינפורמטיקה ניתוחים עבור מחקר זה בוצעו במתקן I2BC הדור הבא (NGS). חברי המתקן I2BC NGS מודעים לקריאה קריטית של כתב היד והצעות מועילות.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
