Immunglobulin G N-glycan-analyse ved ultra-præstations væskekromatografi
Summary
Immunglobulin G (IgG) N-glycan er karakteriseret ved anvendelse af hydrofile interaktions KROMATOGRAFI uplc. Desuden er strukturen af IgG N-glycan klart adskilt. Præsenteret her er en introduktion til denne eksperimentelle metode, så det kan være meget udbredt i forskning indstillinger.
Abstract
Glycomics er en ny subspecialitet i omik system Research, der giver betydelige muligheder for at opdage næste generations biomarkører for sygdoms følsomhed, Drug Target Discovery, og Precision Medicine. Alternative IgG N-glycaner er blevet rapporteret i flere almindeligt forekommende kroniske sygdomme og foreslog at have et stort potentiale i kliniske anvendelser (dvs. biomarkører til diagnosticering og forudsigelse af sygdomme). IgG N-glycans er bredt karakteriseret ved hjælp af metoden til hydrofile interaktion kromatografi (hilic) ultra-performance væskekromatografi (uplc). UPLC er en stabil detekterings teknologi med god reproducerbarhed og høj relativ kvantitativ nøjagtighed. Desuden er strukturen af IgG N-Les klart adskilt, og Les sammensætning og relativ overflod i plasma er karakteriseret.
Introduction
N-glykosylering af humane proteiner er en fælles og vigtig post-translationel modifikation1 og kan hjælpe med at forudsige forekomsten og udviklingen af sygdomme relativt nøjagtigt. På grund af kompleksiteten af sin struktur, forventes det, at der er mere end 5.000 Les strukturer, giver stort potentiale som diagnostiske og forudsigende biomarkører for sygdomme2. N-glycans knyttet til immunglobulin G (IgG) har vist sig at være afgørende for igg’s funktion, og IgG N-glykosylation deltager i balancen mellem Pro-og anti-inflammatoriske systemer3. Differential IgG N-glykosylering er involveret i sygdomsudvikling og progression, der repræsenterer både en disposition og funktionelle mekanisme involveret i sygdoms patologi. Den inflammatoriske rolle IgG N-glykosylation har været forbundet med aldring, inflammatoriske sygdomme, autoimmune sygdomme, og kræft4.
Med udviklingen af detekterings teknologi, er følgende metoder mest udbredte i høj gennemløb Glycomics: hydrofile Interaction kromatografi (HILIC) ultra-performance væskekromatografi med fluorescens detektion (UPLC-FLR), multiplex kapillar gel elektroforese med Laser induceret fluorescens detektion (xCGE-LIF), matrix-assisteret Laser Desorption/ionisering tid-of-Flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS), og væskekromatografi elektro spray massespektrometri (LC-ESI-MS) . Disse metoder har overvundet tidligere mangler af lav flux, ustabile resultater, og dårlig følsomhed specificitet5,6.
Uplc er almindeligt anvendt til at udforske sammenslutningen mellem IgG N-glykosylering og visse sygdomme (dvs. aldrende7, fedme8, dyslipidæmi9, type II diabetes10, hypertension11, iskæmisk slagtilfælde12, og Parkinsons sygdom13). Sammenlignet med de andre tre ovennævnte metoder har uplc følgende fordele:5,14. For det første giver det en relativ kvantitativ analysemetode, og den dataanalyse, der involverer total område normalisering forbedrer sammenligneligheden af hver prøve. For det andet er udgifterne til udstyr og nødvendig ekspertise relativt lave, hvilket gør det lettere at implementere og omdanne glykosylations biomarkører til kliniske anvendelser. Præsenteret her er en introduktion til UPLC, så det kan være mere almindeligt anvendt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uplc fungerer som en relativ kvantitativ analysemetode5,15. Resultaterne indikerer, at UPLC er en stabil detekterings teknologi med god reproducerbarhed og relativ kvantitativ nøjagtighed. Mængden af glycaner i hver spids udtrykkes som en procentdel af det samlede integrerede område ved hjælp af UPLC, som er den relative værdi. Den relative kvantificering forbedrer sammenligneligheden af testprøverne. Derudover bruges 96 brønd protein G plader til at rense…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation i Kina (81673247 & 81872682) og australsk-Kina Collaborative tilskud (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).
Materials
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson’s disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O’Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
