Immunglobulin G N-Glycan analyse av ultra-gjennomførelse flytende kromatografi
Summary
Immunglobulin G (IgG) N-glycan er karakterisert ved hjelp av hydrofile INTERAKSJON kromatografi UPLC. I tillegg er strukturen av IgG N-glycan klart separert. Presentert her er en introduksjon til denne eksperimentelle metoden slik at den kan bli mye brukt i forskning innstillinger.
Abstract
Glycomics er en ny subspecialty i omics system forskning som gir betydelig potensial i å oppdage neste generasjons biomarkører for sykdoms mottakelighet, narkotika mål oppdagelse, og presisjons medisin. Alternativ IgG N-glykaner har blitt rapportert i flere vanlige kroniske sykdommer og foreslo å ha stort potensial i kliniske anvendelser (dvs. biomarkører for diagnostisering og prediksjon av sykdommer). IgG N-glykaner er viden karakterisert ved hjelp av metoden for hydrofile interaksjon KROMATOGRAFI (HILIC) Ultra-ytelse flytende KROMATOGRAFI (UPLC). UPLC er en stabil deteksjons teknologi med god reproduserbarhet og høy relativ kvantitativ nøyaktighet. I tillegg er strukturen av IgG N-glycan klart separert, og glycan sammensetning og relativ overflod i plasma er karakterisert.
Introduction
N-glykosylering av humane proteiner er en felles og viktig post-translational modifikasjon1 og kan bidra til å forutsi forekomsten og utviklingen av sykdommer relativt nøyaktig. På grunn av kompleksiteten i sin struktur, er det forventet at det er mer enn 5 000 glycan strukturer, gir stort potensial som diagnostiske og prediktiv biomarkører for sykdommer2. N-glykaner knyttet til immunglobulin G (IgG) har vist å være avgjørende for IgG funksjon, og IgG N-glykosylering deltar i balansen mellom Pro-og anti-inflammatoriske systemer3. Differensial IgG N-glykosylering er involvert i sykdomsutvikling og progresjon, som representerer både en predisposisjon og funksjonell mekanisme involvert i sykdoms patologi. Den inflammatoriske rollen som IgG N-glykosylering har vært assosiert med aldring, inflammatoriske sykdommer, autoimmune sykdommer, og kreft4.
Med utviklingen av gjenkjennings teknologi er følgende metoder mest brukt i høy gjennomstrømming glycomics: hydrofile interaksjon kromatografi (HILIC) Ultra-ytelse flytende kromatografi med fluorescens deteksjon (UPLC-FLR), multiplex kapillær gel elektroforese med laser indusert fluorescens deteksjon (xCGE-LIF), Matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering time-of-Flight Mass massespektrometri (MALDI-TOF-MS), og flytende kromatografi electrospray Mass massespektrometri (LC-ESI-MS) . Disse metodene har overvunnet tidligere mangler av lav Flux, ustabile resultater, og dårlig følsomhet spesifisitet5,6.
UPLC er mye brukt til å utforske foreningen mellom IgG N-glykosylering og visse sykdommer (dvs. aldring7, fedme8, dyslipidemi9, type II diabetes10, hypertensjon11, iskemiske hjerneslag12, og Parkinsons sykdom13). Sammenlignet med de tre andre ovennevnte metoder, har UPLC følgende fordeler5,14. For det første gir det en relativ kvantitativ analysemetode, og dataanalysen som involverer totalareal normalisering, forbedrer sammenlignbarhet for hvert utvalg. For det andre er kostnaden av utstyr og nødvendig ekspertise relativt lav, noe som gjør det enklere å implementere og transformere glykosylering biomarkører til kliniske anvendelser. Presentert her er en introduksjon til UPLC så det kan bli mer utbredt.
Protocol
Representative Results
Discussion
UPLC fungerer som en relativ kvantitativ analysemetode5,15. Resultatene tyder på at UPLC er en stabil deteksjons teknologi med god reproduserbarhet og relativ kvantitativ nøyaktighet. Mengden av glykaner i hver topp er uttrykt som en prosentandel av det totale integrerte området ved hjelp av UPLC, som er den relative verdien. Den relative kvantifisering forbedrer sammenlignbarhet til testprøvene. I tillegg brukes 96 brønn protein G-plater til å rense IgG me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (81673247 & 81872682) og australsk-Kina Collaborative Grant (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).
Materials
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson’s disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O’Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
