Isolement des populations neuronales spécifiques de Roundworm Caenorhabditis elegans
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement simple des groupes spécifiques des cellules neuronales vivantes exprimant la protéine fluorescente verte des lignes transgéniques de Caenorhabditis elegans. Cette méthode permet une variété d’études ex vivo axées sur des neurones spécifiques et a la capacité d’isoler les cellules pour la culture à court terme.
Abstract
Pendant le processus de vieillissement, beaucoup de cellules accumulent des niveaux élevés de dommages menant au dysfonctionnement cellulaire, qui sous-tend beaucoup de conditions gériatriques et pathologiques. Les neurones post-mitotiques représentent un type de cellule majeur affecté par le vieillissement. Bien que de multiples modèles mammifères du vieillissement neuronal existent, ils sont difficiles et coûteux à établir. Le ver rond Caenorhabditis elegans est un modèle puissant pour étudier le vieillissement neuronal, car ces animaux ont une courte durée de vie, une boîte à outils génétique robuste disponible, et un système nerveux bien catalogué. La méthode présentée ici permet un isolement sans faille de cellules spécifiques basées sur l’expression d’une protéine fluorescente verte transgénique (GFP). Les lignées animales transgéniques exprimant le PFG sous des promoteurs distincts, spécifiques au type cellulaire, sont digérées pour enlever la cuticule externe et délicatement perturbées mécaniquement pour produire de la boue contenant divers types de cellules. Les cellules d’intérêt sont ensuite séparées des cellules non ciblées par le tri des cellules activées par la fluorescence, ou par des perles magnétiques couplées à l’anti-GFP. Les cellules isolées peuvent ensuite être cultivées pour un temps limité ou immédiatement utilisées pour des analyses ex vivo spécifiques à des cellules telles que l’analyse transcriptionnelle par PCR quantitatif en temps réel. Ainsi, ce protocole permet une analyse rapide et robuste des réponses spécifiques aux cellules au sein de différentes populations neuronales chez C. elegans.
Introduction
Au cours des dernières décennies, l’organisme modèle métazoaire Caenorhabditis elegans a été un atout énorme dans l’étude des neurones, des circuits neuronaux et de son rôle dans les réponses physiologiques et comportementales, et les neurodégénératifs associés au vieillissement Maladies. Une caractéristique unique de C. elegans est que les animaux sont transparents, permettant à la lignée de toutes les cellules somatiques adultes d’être cartographié1. C. elegans abrite également une quantité gérable de neurones, conduisant à la morphologie et la connectivité du système nerveux étant bien compris2. La lignée cellulaire invariante, la courte durée de vie et l’abondance d’outils génétiques à haut débit disponibles pour C. elegans en font un organisme modèle idéal pour l’étude du vieillissement au sein de différentes populations neuronales.
Le vieillissement des neurones et des troubles neurodégénératifs est complexe, et chaque trouble a des signatures pathologiques uniques qui lui sont associées. Cependant, pour beaucoup de ces désordres, tels que la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer, une caractéristique commune est la charge progressive des protéines mal repliées3,4,5. Dans ces deux maladies, les protéines se dissemblent et s’agrégent à l’intérieur de la cellule pour causer une toxicité, conduisant finalement à la mort cellulaire4,5. Pour le vieillissement approprié des neurones, l’homéostasie des mitochondries, plus particulièrement l’homéostasie protéique, est importante, car les perturbations et la dyshomeostasie peuvent mener à la neurodégénérescence6,7,8. Les cellules sont équipées de divers mécanismes pour maintenir l’homéostasie des protéines, l’un étant la réponse des protéines dépliée (UPR) – une voie classique où les signaux du réticulum endoplasmique (ER) activent des cascades de signaux intracellulaires, conduisant à une transcription réponse9. Semblable à cette ERUPR, métazoaires montrent une réponse similaire à la perte de l’homéostasie de protéine mitochondriale, le soi-disant mitochondrial UPR (UPRmt)7,8. C. elegans semble être l’organisme le plus basal à avoir une voie confirmée et bien définie UPRmt 7.
La fonction/dysfonctionnement de populations neuronales spécifiques au sein d’un réseau plus vaste peut être difficile à évaluer en raison de leur connectivité intrinsèque et de leur complexité3. Cependant, il est souvent nécessaire d’étudier des populations neuronales distinctes en raison de maladies spécifiques au type cellulaire avec des pathologies complexes, telles que celles associées à l’homéostasie des protéines cellulaires altérées. Chez C. elegans, des populations neuronales spécifiques peuvent être manipulées génétiquement permettant une observation facile in vivo. Le système nerveux de C. elegans se compose principalement de neurones, avec un petit pourcentage de cellules gliales. Chez les vers hermaphrodite adultes, il y a environ 302 neurones, subdivisés en plus de 100 classes différentes2,10. Les neurones tels que les neurones cholinergiques prédominent dans les jonctions neuromusculaires, tandis que les neurones dopaminergiques sont principalement impliqués dans la sensation10,11. Comme l’activité motrice et les capacités sensorielles diminuent avec l’âge, il est important de détailler les idées mécanistes sur les défauts dans ces neurones individuels11,12. En tant que tel, il est nécessaire d’avoir une méthode simple et robuste pour isoler les cellules intactes d’intérêt pour les études ex vivo ultérieures.
Ici, nous décrivons une méthode efficace optimisée pour l’isolement rapide des cellules neuronales spécifiques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) de C. elegans. Cette méthode d’isolement peut être pratiquée sur les vers larvaires, juvéniles ou adultes. L’isolement des cellules des vers larvaires a été précédemment édité par Zhang et autres13 et ne sera pas discuté ici. Une note importante ici est que tous les vers doivent être au même stade de vie pour empêcher la surdigestion de l’animal ou la contamination des animaux à différents stades de la vie. Grâce à la perturbation enzymatique et mécanique de la cuticule nématode, un exosquelette riche en collagène et d’autres protéines structurelles, une grande variété de cellules peut être isolée13,14. Les cellules peuvent ensuite être isolées par cytométrie du débit ou anticorps étiquetés perles magnétiques. Typiquement, l’ARN est isolé par l’intermédiaire d’une méthode d’isothiocyanate de phénol et de guanidine pour assurer l’enrichissement de la population cellulaire désirée15. Avec beaucoup de soin ces cellules isolées peuvent être maintenues dans un flacon de culture ou un plat multi-bien. Cette méthode représente un outil unique et puissant dans l’étude de neurones spécifiques et a la capacité d’isoler les cellules vivantes et fonctionnelles pour la culture ultérieure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le ver rond C. elegans est un modèle bien établi et puissant pour étudier la santé neuronale et la maladie2. Avec de nombreux outils génétiques pour manipuler ces animaux et une quantité gérable de différents types de neurones, beaucoup de données peuvent être recueillies avec une quantité relativement faible de matériel. Ici, nous dénoncons une méthode optimisée pour isoler les neurones distincts des animaux entiers. En perturbant les protéines cuticules externes du ver,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la Dre Jennifer Fox et les membres du laboratoire Khalimonchuk pour leurs commentaires perspicaces. Nous reconnaissons le soutien des National Institutes of Health (R01 GM108975 à O.K. et T32 GM107001-01A1 à E.M.G.).
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
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