Изоляция лейкоцитов от грудного молока человека для использования в антитела-зависимых клеточного фагоцитоза Ассей ВИЧ Цели
Summary
Грудное молоко передает вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), хотя только 15% младенцев, накормленных ВИЧ-инфицированными матерями, заражаются. Грудное вскармливание младенцев глотать 105и 108 материнских лейкоцитов ежедневно, хотя эти клетки недостаточно изучены. Здесь мы описываем изоляцию лейкоцитов грудного молока и анализ их фагоцитарной способности.
Abstract
Даже при отсутствии антиретровирусных препаратов, только 15% младенцев, накормленных ВИЧ-инфицированными матерями, заражаются, что свидетельствует о сильном защитном эффекте грудного молока (БМ). Если доступ к чистой воде и соответствующим детским смесям не является надежным, ВОЗ не рекомендует прекратить грудное вскармливание для ВИЧ-инфицированных матерей. Многочисленные факторы, вероятно, работают в тандеме, чтобы уменьшить передачу БМ. Грудное вскармливание младенцев глотать 105и 108 материнских лейкоцитов ежедневно, хотя то, что остается в значительной степени неясно, является вклад этих клеток в противовирусные качества БМ. В настоящее время мы стремились изолировать клетки от человека БМ для того, чтобы измерить антитела-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), один из самых важных и всепроникающих врожденных иммунных реакций, бМ-фагоцитов против ЦЕЛЕй ВИЧ. Клетки были выделены из 5 образцов БМ человека, полученных на различных стадиях лактации. Изоляция осуществлялась с помощью мягкой центрифугации с последующим тщательным удалением молочного жира и повторным промыванием клеточных гранул. Флуоресцентные бусы, покрытые эпитопом конверта С ВИЧ (Env), использовались в качестве мишеней для анализа ADCP. Клетки были окрашены маркером поверхности CD45 для идентификации лейкоцитов. Было установлено, что активность ADCP была значительно выше контрольных экспериментов и воспроизводима с помощью АНТИтела 830А, характерного для ВИЧ.
Introduction
Грудное молоко человека (BM) состоит из материнских клеток, которые являются жизнеспособными1. Состав клеток сильно влияет на стадию лактации, состояние здоровья матери и младенца, и индивидуальный вариант, который остается плохоизученным1,2,3,4. Учитывая, что БМ содержит 103й 105 лейкоцитов/мл, можно подсчитать, что грудное вскармливание младенцев глотать 105и 108 материнских лейкоцитов ежедневно5. Различные исследования in vivo показали, что материнские лейкоциты обеспечивают критический иммунитет к младенцу и функционируют далеко за пределами этих мест первоначального приема5,6,7,8 ,9,10,11. Все материнские клетки, проглоченные младенцем, обладают потенциалом для выполнения иммунных функций наряду или для компенсации собственных лейкоцитов младенца12.
Передача вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) от матери ребенку остается кризисом в странах с ограниченными ресурсами. Поскольку диарейные и респираторные заболевания являются причиной значительных показателей смертности среди младенцев в странах с ограниченными ресурсами, и эти болезни значительно сокращаются за счет исключительно грудного вскармливания, выгоды для ВИЧ-инфицированных матерей грудное вскармливание намного перевешивает риски13,14,15. Если доступ к чистой воде и соответствующим детским смесям не является надежным, ВОЗ не рекомендует прекратить грудное вскармливание для ВИЧ-инфицированных матерей16. Приблизительно 100 000 MTCTs через БМ происходят ежегодно; тем не менее, только 15% младенцев, накормленных грудью их ВИЧ-инфицированных матерей заражаются, предполагая сильный защитный эффект BM17,18,19,20,21. Многочисленные факторы, вероятно, работают в тандеме, чтобы предотвратить передачу инфекции. Важно отметить, что ВИЧ-специфические антитела (Abs) в БМ были коррелированы с сокращением MTCT и / или снижение младенческой смертности от ВИЧ-инфекции22,23. Что остается в значительной степени неясным является вклад клеточной фракции БМ его противовирусные качества.
Многие Abs облегчить различные антивирусные деятельности при посредничестве “постоянной” области молекулы иммуноглобулина, кристаллизуемый фрагмент (Fc), через взаимодействие с рецепторами FC (FcRs) найти практически на всех врожденных иммунных клеток, практически все из которых встречаются в человеке BM24. Антитела-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) был продемонстрирован как необходимый для очистки вирусных инфекций и был недостаточно изучен в случае профилактики MTCT ВИЧ25,26,27, 28 , 29. Учитывая нехватку знаний о потенциальном вкладе активности ADCP бМ фагоцитов в профилактику MTCT ВИЧ, мы стремились разработать строгий метод изоляции клеток от человеческого БМ для проведения исследования ADCP при посредничестве клеток из БМ, полученный на различных стадиях лактации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод цитометрии на основе потока для измерения активности ADCP, описанный в настоящем вопросе, был впервые описан в 2011году 30 и с тех пор был доказан надежным и цитируется в более чем 80 исследованиях. Описанный здесь протокол впервые адаптирует этот метод для использования с …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Сьюзан Золла-Пазнер на кафедре медицины и кафедре микробиологии в Медицинской школе Икан на горе Синай за отзыв рукописей. NIH/NICHD предоставила финансирование этого проекта под грантовый номер R21 HD095772-01A1. Кроме того, Р. Пауэлл был поддержан за счет средств из Департамента медицины, Отдел инфекционных заболеваний, Icahn школы медицины на горе Синай.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer’s Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. . Antibody Fc. , (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
