Isolering av leukocyter från human bröstmjölk för användning i en antikroppsberoende cellulära fagocytos analys av HIV-mål
Summary
Bröstmjölk överför humant immunbristvirus (HIV), men endast ~ 15% av spädbarn ammade av HIV-infekterade mödrar blir smittade. Ammade spädbarn mata in ~ 105− 108 moderns leukocyter dagligen, även om dessa celler är understuderade. Här beskriver vi isoleringen av bröstmjölk leukocyter och en analys av deras fagocytos kapacitet.
Abstract
Även i avsaknad av antiretrovirala läkemedel, endast ~ 15% av spädbarn ammade av HIV-infekterade mödrar blir smittade, vilket tyder på en stark skyddande effekt av bröstmjölk (BM). Om inte tillgång till rent vatten och lämplig modersmjölksersättning är tillförlitlig, WHO rekommenderar inte upphörande av amning för HIV-infekterade mödrar. Många faktorer som sannolikt arbetar parallellt för att minska BM överföring. Ammade spädbarn mata in ~ 105− 108 moderns leukocyter dagligen, men vad som fortfarande är till stor del oklart är bidraget från dessa celler till de antivirala kvaliteter av BM. för närvarande syftade vi till att isolera celler från Human BM för att mäta antikroppsberoende cellulära fagocytos (ADCP), en av de mest väsentliga och genomträngande medfödda immunsvar, av BM fagocyter mot HIV-mål. Cellerna isolerades från 5 humana BM-prover som erhållits i olika stadier av amning. Isolering utfördes via mild centrifugering följt av noggrann borttagning av mjölkfett och upprepad tvättning av cellpelleten. Fluorescerande pärlor belagda med HIV-kuvert (ENV) epitop användes som mål för analys av ADCP. Celler färgas med CD45 yta markör för att identifiera leukocyter. Det konstaterades att ADCP-aktiviteten var signifikant över kontroll experiment och reproducerbart mätbar med hjälp av en HIV-specifik antikropp 830A.
Introduction
Human bröstmjölk (BM) består av moderns celler som är > 90% livskraftiga1. Cell sammansättningen påverkas starkt av skede av amning, hälsostatus av mor och spädbarn, och individuell variation, som fortfarande är dåligt förstådd1,2,3,4. Med tanke på att BM innehåller ~ 103− 105 leukocyter/ml, det kan uppskattas att ammade spädbarn mata in ~ 105− 108 maternella leukocyter dagligen5. Olika in vivo studier har visat att moderns leukocyter ger kritisk immunitet mot barnet och är funktionella långt bortom dessa platser för initial förtäring5,6,7,8 ,9,10,11. Alla materneligt framställda celler som intas av spädbarnet har potential att utföra immunförsvaret vid sidan av eller kompensera för spädbarnets egna leukocyter12.
Överföring från mor till barn (MTCT) av humant immunbristvirus (HIV) är fortfarande en kris i resursbegränsade länder. Som diarré och luftvägssjukdomar är ansvariga för betydande dödlighet bland spädbarn i resurs-begränsade länder, och dessa sjukdomar reduceras avsevärt genom exklusiv amning, fördelarna för hiv-infekterade mödrar av amning vida uppväger riskerna13,14,15. Om inte tillgång till rent vatten och lämplig modersmjölksersättning är tillförlitlig, WHO rekommenderar inte upphörande av amning för HIV-infekterade mödrar16. Ungefärligt 100 000 MTCTs via BM uppstår årligen; ändå, bara ~ 15% av spädbarn ammade av deras hiv-infekterade mödrar blir smittade, vilket tyder på en stark skyddande effekt av BM17,18,19,20,21. Många faktorer fungerar sannolikt parallellt för att förhindra överföring. Viktigt, HIV-specifika antikroppar (ABS) i BM har korrelerats med minskad MTCT och/eller reducerad spädbarnsdöd från hiv-infektion22,23. Det som fortfarande till stor del är oklart är bidraget från den cellulära fraktionen av BM till dess antivirala egenskaper.
Många ABS underlätta en mängd anti-virala aktiviteter medieras av den “konstanta” regionen av immunglobulin molekylen, den kristalliserbara fragment (FC), via interaktion med FC-receptorer (FcRs) finns på nästan alla medfödda immunceller, praktiskt taget alla som finns i human BM24. Antikroppsberoende cellulära fagocytos (ADCP) har visats som nödvändigt för clearance av virusinfektioner och har varit understuderat vid förebyggande av MTCT av hiv25,26,27, 28 , 29. med tanke på bristen på kunskap om det potentiella bidraget av ADCP verksamhet av BM fagocyter till förebyggande av MTCT av hiv, syftade vi till att utveckla en rigorös metod för att isolera celler från Human BM för att genomföra en studie av ADCP medierad av celler från BM som erhållits i olika stadier av amning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flödescytometribaserad teknik för mätning av ADCP-aktivitet som beskrivs häri beskrevs först i 201130 och har sedan dess bevisats vara robust och citerad i mer än 80 studier. Det protokoll som beskrivs här anpassar denna teknik för användning med primära BM-celler för första gången. Tidigare studier av FC-medierad funktionalitet av BM-celler har i stort sett begränsats till mätning av oxidativa skurar eller histologisk-baserade fagocytos-analyser med celler isolerade från rå mjöl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Susan Zolla-Pazner vid Institutionen för medicin och Institutionen för mikrobiologi vid Icahn School of Medicine på Mount Sinai för manuskriptet granskning. NIH/NICHD tillhandahöll finansiering för detta projekt under bidrags nummer R21 HD095772-01A1. Dessutom stöddes R. Powell av medel från Institutionen för medicin, avdelningen för infektionssjukdomar, Icahn School of Medicine vid berget Sinai.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer’s Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. . Antibody Fc. , (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
