Måling af Chitinaseaktivitet i biologiske prøver

Summary

Præsenteret her er en simpel metode til at måle chitinase aktivitet i biologiske væsker såsom bronalveolær skylning eller serum.

Abstract

Chitinaser er de enzymer, der kløver chitin. Selv i fravær af chitin, mammalianere har betydelige mængder af chitinaser til stede i kroppen, herunder ved baseline. Den præcise rolle chitinase er ikke kendt, men det menes at spille en vigtig rolle i fordøjelsen og vært forsvar mod chitin-holdige fødevarer og patogener, hhv. Nylige arbejde, herunder vores, har vist en vigtig rolle af chitinase og chitinase-lignende proteiner i værts immunitet og allergiske sygdomme. Vigtigere, chitinase aktiviteter tjene som vigtige biomarkører af sygdom sværhedsgrad i en bred vifte af sygdomme, herunder type 2 inflammatoriske sygdomme som astma og pulmonal fibrose. Tilsvarende, patienter med genetiske lidelser som Gauchers sygdom har signifikant forhøjet chitinase niveauer, som ikke kun korrelerer med sygdommens sværhedsgrad, men også tjene som en pålidelig biomarkør for terapeutisk effektivitet. Den protokol, der er skitseret her, beskriver en enkel, hurtig og ligetil måde at måle chitinaseaktivitet i BAL eller serumprøver af mus og kan være bredt tilpasset til mennesker og andre modelorganismer på grund af enzymernes stærkt bevaret karakter.

Introduction

Chitin er den næstmest rigelige polysaccharid på jorden efter cellulose, der tjener som en vigtig strukturel bestanddel af en række organismer, herunder exoskelettet af insekter, svampe, gær og alger; nogle hvirveldyr har også chitin¹. Chitinaser er en familie af enzymer, der er i stand til at nedbryde chitin og er meget bevaret gennem udviklingen i arter lige fra bakterier til pattedyr^2,3. Ud over chitinaser har pattedyr også chitinase-lignende proteiner, der ligner chitinaser i deres evne til at binde chitin, men adskiller sig ved, at de mangler enzymatisk evne til at kløve chitin⁴.

Selvom chitin og chitinaser længe er blevet undersøgt — med undersøgelser, som går tilbage til begyndelsen af 1900-tallet — har hovedfokus været på deres rolle i insekter og andre hvirvelløse dyr. Faktisk var det først i 1960 ‘ erne, hvor hvirveldyr fandtes at have chitinaser overhovedet. Ved hjælp af en chitobiase-baseret analyse blev der påvist chitinaser i fordøjelseskanalen for en række hvirveldyr, herunder firben og blackbirds — en observation, der kan tilskrives indtagelse af chitin-holdige organismer som insekter⁵ .

Pattedyr har to enzymatisk aktive former af chitinase: Sure pattedyr chitinase (amcase; også kendt som CHIT2 og CHIA) og at (CHIT1)⁴. Begge disse proteiner er i stand til hydrolyserende chitin. Men, CHIT1 er mere enzymatisk aktiv i mennesker, hvor næsten alle chitinase aktivitet er afledt af CHIT1. ⁴ i mus bidrager både Chit1 og amcase næsten ligeligt til den samlede chitinaseaktivitet⁶. På den anden side, chitinase-lignende proteiner mangler chitinase aktivitet.

Chit1 udskilles hovedsageligt af makrofager og anses ofte for at være et immunrespons på chitin-holdige patogener⁷. Enzymet har også vist sig at være involveret i modning af monocytter i både M1 og m2 makrofag undertyper, selv uden tilstedeværelsen af substratet chitin⁸. Desuden kan det også være involveret i modning af andre immunceller, herunder T Helper Type 2 (Th2) celler og eosinofiler — som det viste sig at være tilfældet i kryptokok-Lungeinfektion⁹. Disse undersøgelser peger på en kompleks rolle af chitinaser i immunsystemet.

I de seneste år, Chit1 niveauer har været fundet at tjene som en vigtig biomarkør af progression for over 40 forskellige menneskelige sygdomme, herunder lysosomale opbevarings sygdomme, smitsomme sygdomme, luftvejssygdomme, Endokrinologiske sygdomme, kardiovaskulære sygdomme, neurologiske sygdomme og andre (anmeldt¹⁰). I mange af disse sygdomme er niveauerne af Chit1 en stærk indikator for sygdommens sværhedsgrad og terapeutiske effektivitet¹⁰.

Som chitinaser har fået et ry som en biomarkør for talrige medicinske tilstande, herunder Gauchers sygdom, værktøjer og assays er blevet udviklet for at lette testning for chitinase tilstedeværelse. Ældre metoder omfatter Schales ‘ procedure, en protokol tilpasset fra en blodglukose test, og den 3, 5 dinitrosalicylic syre (DNS) metode. Men disse metoder er ofte tidsfølsomme og teknisk vanskelige¹¹. Proceduren for begge disse tests kræver reduktion af uorganiske oxidanter, Ferricyanid i tilfælde af Schales ‘ procedure for eksempel, fremstilling af en farveændring, der kun kan måles spektrofotometrisk. Derudover, begge tests involverer en opvarmning eller kogning skridt, der er både tidskrævende og nødvendigt for farven til at udvikle^12,13.

Beskrevet her er en hurtig og enkel fluorimetrisk analyse til bestemmelse af chitinaseniveauerne i pattedyrs prøver^14,15. To af de prøver, der anvendes her omfatter serum og bronalveolære skylning væsker (bal); chitinaseaktiviteten er også blevet målt i modermælk og urinprøver, og teknikken kan udføres i den type prøver samt i enhver anden biologisk væske^16,17.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til en IACUC-godkendt protokol på Yale University School of Medicine. 1. samling af muse prøver Bedøvelse Anesthetize mus ved hjælp af ketamin og xylazin (100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg af xylazin). Blodprøve samling Bekræft dybden af anæstesi ved ikke-reaktionsevne til en tå knivspids. Kirurgisk åbning af brysthulen for at afsløre hjertet. …

Representative Results

De resultater, der er vist her, er fra en undersøgelse, der måler chitinaseaktiviteten i serum-og BAL-prøver af vildtype (C57BL/6) og Chit1 Transgene mus (på C57BL/6 baggrund), som overudtrykker det Chit1 gen på en doxycyclinpromotor. Vores data viser, at både serum-og BAL-prøverne har detekterbar chitinaseaktivitet ved baseline 698,2 ± 189,9 nmol/mL · h og 485,7 ± 114 nmol/ml · h. Overekspression af Chit1-genet ved hjælp af doxycyclin i drikkevand i 4 uger resulterede i en forhøjelse af chitinaseaktiviteten…

Discussion

Chitinaseaktiviteten er opstået som en vigtig biomarkør til forudsigelse af sygdoms sværhedsgrad, sygdomsprogression, terapeutisk effektivitet og tilstedeværelsen af specifikke patogener¹⁸. Selv om mange af de lang-postulerede teorier om rollen af chitinaser ikke har været eksperimentelt bevist¹⁹, nye undersøgelser har givet vigtig indsigt i rollen af chitinaser og chitinase som proteiner i forskellige sygdomme^{2, 9…}

Materials

4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224