Måling av Chitinase aktivitet i biologiske prøver

Summary

Presentert her er en enkel metode for å måle chitinase aktivitet i biologiske væsker som lunges tømming eller serum.

Abstract

Chitinases er enzymer som Cleave kitin. Selv i fravær av kitin, mammalians har betydelige mengder chitinases tilstede i kroppen, inkludert ved Baseline. Den presise rolle chitinase er ikke kjent, men det ble antatt å spille viktig rolle i fordøyelsen og vert forsvar mot kitin-inneholdende mat og patogener, henholdsvis. Nyere arbeid, inkludert vår, har vist en viktig rolle i chitinase og chitinase proteiner i verts immunitet og allergiske sykdommer. Viktigere, chitinase aktiviteter tjene som viktig biomarkører av sykdom alvorlighetsgrad i en rekke sykdommer, inkludert type 2 inflammatoriske sykdommer som astma og pulmonal fibrose. Tilsvarende pasienter med genetiske lidelser som Gaucher sykdom har betydelig forhøyet chitinase nivåer, som ikke bare samsvarer med sykdoms alvorlighetsgrad, men også tjene som en pålitelig biomarkør for terapeutisk effektivitet. Protokollen skissert her beskriver en enkel, rask og grei måte å måle chitinase aktivitet i BAL eller serumprøver av mus og kan være allment tilpasset menneskelige og andre modell organismer på grunn av den svært bevarte natur enzymer.

Introduction

Kitin er den nest mest tallrike polysakkarid på jorden etter cellulose, som tjener som en viktig strukturell komponent i en rekke organismer, inkludert Exoskeleton av insekter, sopp, gjær og alger; noen virveldyr har også kitin¹. Chitinases er en familie av enzymer som er i stand til å bryte ned kitin og er svært bevart gjennom utviklingen i arter som spenner fra bakterier til pattedyr^2,3. I tillegg til chitinases, pattedyr har også chitinase-lignende proteiner som ligner chitinases i deres evne til å binde kitin men varierer i at de mangler enzymatisk evne til å holde fast i kitin⁴.

Selv om kitin og chitinases har lenge vært studert-med undersøkelser dateres tilbake til tidlig på 1900-tallet-hovedfokuset har vært på sin rolle i insekter og andre virvelløse dyr. Faktisk var det ikke før på 1960-tallet da virveldyr ble funnet å ha chitinases i det hele tatt. Ved hjelp av en chitobiase-basert analyse, ble chitinases vist å være funnet i fordøyelseskanalen av en rekke virveldyr inkludert øgler og blackbirds-en observasjon hypotetisk gjennomsnitt å være på grunn av inntak av kitin-inneholdende organismer som insekter⁵ .

Pattedyr har to enzymatisk aktive former for chitinase: Sure pattedyr chitinase (AMCase; også kjent som CHIT2 og CHIA) og chitotriosidase (CHIT1)⁴. Begge disse proteinene er i stand til hydroloserende kitin. Imidlertid, CHIT1 er flere enzymatisk aktiv inne human, der hvor nært alle av chitinase aktivitet er avledet fra CHIT1. ⁴ i mus, både Chit1 og AMCase nesten like bidra til den samlede chitinase aktivitet⁶. På den annen side, chitinase-lignende proteiner mangler chitinase aktivitet.

Chit1 utskilles hovedsakelig av makrofager og blir ofte betraktet som immunrespons på kitin patogener⁷. Enzymet har også vist seg å være involvert i modning av monocytter i både M1 og m2 macrophage under typer, selv uten tilstedeværelsen av underlaget kitin⁸. Videre kan det også være involvert i modning av andre immunceller inkludert T hjelper type 2 (Th2) celler og eosinofile-som ble vist å være tilfelle i kryptokokkmeningitt lungeinfeksjon⁹. Disse studiene peker på en kompleks rolle chitinases i immunsystemet.

I de senere årene, Chit1 nivåer har blitt funnet å tjene som en viktig biomarkør av progresjon for over 40 forskjellige menneskelige sykdommer, inkludert lysosomal lagring sykdommer, smittsomme sykdommer, luftveissykdommer, endocrinological sykdommer, kardiovaskulær sykdommer, nevrologiske sykdommer, og andre (anmeldt¹⁰). I mange av disse sykdommene, nivåene av Chit1 er en sterk indikasjon på sykdom alvorlighetsgrad og terapeutisk effektivitet¹⁰.

Som chitinases har fått et rykte som en biomarkør for en rekke medisinske tilstander, inkludert Gaucher sykdom, har verktøy og analyser blitt utviklet for å lette testingen for chitinase tilstedeværelse. Eldre metoder inkluderer Schales ‘ prosedyre, en protokoll tilpasset fra en blod glukose test, og 3, 5 dinitrosalicylic acid (DNS) metoden. Men disse metodene er ofte tid følsomme og teknisk vanskelig¹¹. Fremgangsmåten for begge disse testene krever reduksjon av uorganiske oksidanter, ferricyanide i tilfelle av Schales ‘ prosedyre for eksempel, produsere en fargeendring som bare kan måles spektrofotometrisk. I tillegg er begge testene innebære en oppvarming eller kokende trinn som er både tidkrevende og nødvendig for fargen å utvikle^12,13.

Beskrevet her er en rask og enkel fluorimetric analysen for å bestemme chitinase nivåer i pattedyr prøver^14,15. To av prøvene som brukes her, inkluderer serum og lunges (BAL); chitinase aktivitet har også blitt målt i morsmelk og urinprøver, og teknikken kan utføres i disse type prøver så vel som i alle andre biologiske væske^16,17.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført under en IACUC-godkjent protokoll ved Yale University School of Medicine. 1. eksempel samling for mus Bedøvelsen Bedøve mus som bruker ketamin og xylazine (100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazine). Innsamling av blodprøver Bekreft dybden av anestesi ved ikke-respons til en tå knipe. Kirurgisk åpne brystet hulrom for å avdekke hjertet. Sett inn en 2…

Representative Results

Resultatene som vises her er fra en studie som måler chitinase aktivitet i serum og BAL prøver av vill type (C57BL/6) og Chit1 transgene mus (på C57BL/6 bakgrunn) som overekspresjon Chit1 genet på en Doxycycline promoter. Våre data viser at både serum og BAL prøver har synlig chitinase aktivitet ved Baseline 698,2 ± 189,9 nmol/mL · h og 485,7 ± 114 nmol/ml · h, henholdsvis. Overuttrykte av Chit1 genet bruker Doxycycline i drikkevann i 4 uker resulterte i heving av chitinase aktivitet som ble observert i både …

Discussion

Chitinase aktivitet har dukket opp som en viktig biomarkør for å forutsi sykdoms alvorlighetsgrad, sykdomsprogresjon, terapeutisk effektivitet og tilstedeværelsen av bestemte patogener¹⁸. Selv om mange av de lange postulert teoriene om rollen til chitinases ikke har blitt eksperimentelt bevist¹⁹, har nye studier gitt viktig innsikt i rollen som chitinases og chitinase som proteiner i ulike sykdommer^{2, 9,</s…}

Materials

4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224