В Ситу Мониторинг переходно сформированных молекулярных сборок чаперона в бактериях, дрожжах и клетках человека
Summary
Cognate J-домен белки сотрудничать с Hsp70 сопровождающего, чтобы помочь в множество биологических процессов, начиная от белка складывания к деградации. Здесь мы описываем на месте перевязки перевязки, которая позволяет мониторинг этих преходящее сяоченное машиностроения в бактериальных, дрожжей и человеческих клеток.
Abstract
Белки J-домена (JDP) образуют самую большую и разнообразную семейство со-чаперонов в эукариотических клетках. Недавние результаты показывают, что конкретные члены семьи JDP могут образовывать переходные гетерокомплексы в эукариотах для тонкой настройки подложки для 70 kDa теплового шока белка (Hsp70) на основе сопровождающих протеинов дезагрегазы. Комплексы JDP нацелены на острый/хронический стресс, индуцированный агрегированными белками, и, предположительно, помогают собрать дезагрегазы, набирая несколько Hsp70 на поверхность белковых агрегатов. Степень сети контроля качества белка ( P’C), образованная этими физически взаимодействующими JDPs, остается в значительной степени нехарактерной in vivo. Здесь мы описываем на основе микроскопии на основе на месте белка взаимодействия анализ называется близость перевязки анализ (PLA), который способен надежно захватить эти преходяще ежило сформированных комплексов сопровождающего в различных клеточных отсеков эукариотических клеток. Наша работа расширяет занятость НОАК от человеческих клеток до дрожжей(Saccharomyces cerevisiae) и бактерий (Escherichia coli), таким образом, что делает важным инструментом для мониторинга динамики переходно сформированных белковых сборок в обоих прокариотических и эукариотических клеток.
Introduction
Огромное количество геномной информации остается неистолималомируемым из-за нашего неполного понимания клеточных interactomes. Обычные методики обнаружения взаимодействия белка и белка, такие как белок, совместно ездовые с/без химического перекрестного соединения и колокализации белка, хотя и широко используется, представляют собой ряд недостатков. Некоторые из основных недостатков включают плохую количественную оценку взаимодействий и потенциальное введение неместных обязательных событий. Для сравнения, новые методы, основанные на близости, обеспечивают альтернативу и мощный подход к захвату белковых взаимодействий в клетках. Анализ перевязки близости (PLA)1, теперь доступен как собственный комплект, использует антитела специально целевых белковых комплексов, основанных на близости взаимодействующих подразделений.
НОАК инициируется формированием эшафота, состоящего из первичных и вторичных антител с небольшими днк-тегами (зондами НОАК) на поверхности целевого белкового комплекса(рисунок1, шаги 1-3). Далее, определяется близость днк-меток, круговая молекула ДНК генерируется путем гибридизации с разъемом олигонуклеотидов(Рисунок 1, шаг 4). Формирование круговой ДНК завершается шагом перевязки ДНК. Вновь сформированный круговой кусок ДНК служит шаблоном для последующего усиления подвижного круга (RCA) на основе полимеразы цепной реакции (ПЦР) загрунтовать одним из конъюгированных олигонуклеотидов метки. Это генерирует одноцепочечную конкатемерную ДНК-молекулу, прикрепленную к белковому комплексу через эшафот антител(рисунок1, шаг 6). Конкатемерная молекула ДНК визуализирована с помощью флуоресцентно помеченных олигонуклеотидов, которые гибридизируются с несколькими уникальными последовательностями, разбросанными по усиленной ДНК(Рисунок1, шаг 7)2. Сгенерированный сигнал PLA, который выглядит как флуоресцентная точка(рисунок1, шаг 7), соответствует расположению целевого белкового комплекса в клетке. В результате анализ мог обнаружить белковые комплексы с высокой пространственной точностью. Техника не ограничивается просто захвата белковых взаимодействий, но также может быть использован для обнаружения отдельных молекул или белков изменения на белки с высокой чувствительностью1,2.
Hsp70 образует весьма универсальную систему сопровождающего фундаментально важно для поддержания клеточного белка гомеостаза, участвуя в массиве домашнего хозяйства и связанных со стрессом функций. Деятельность по ведению домашнего хозяйства системы Hsp70 включает складывание белка de novo, перенос белка через клеточные мембраны, сборку и разборку белковых комплексов, регуляцию белковой активности и увязку различных сворачиваний белков/ машины контроля качества3. Та же система сопровождающего также сбрасывает неправильно сложенные/развернутые белки, предотвращает агрегацию белка, способствует дезагрегированию белка и сотрудничает с клеточными протеазами, чтобы деградировать неизлечимо неправильно сложенные/поврежденные белки для облегчения клеточного ремонта после протеотоксические напряжения4,5. Для достижения этого функционального разнообразия, Hsp70 сопровождающий опирается на партнерские со-chaperones семьи JDP и нуклеотидных обменных факторов (NEFs), которые тонкой настройки Hsp70 в ATP-зависимый аллостерный контроль субстрата связывания и релиз3, 6. Кроме того, со-сопровождающие JDP играют жизненно важную роль в выборе субстратов для этой универсальной системы сопровождающего. Члены этой семьи подразделяются на три класса (A, B и C) на основе их структурной гомологии к прототипу JDP, E. coli DnaJ. JDPs класса A содержит N-терминальный J-домен, который взаимодействует с Hsp70, богатым глицином-фенилаланином, областью связывания субстрата, состоящей из цинкового пальца, похожего на область (ЗФЛР) и двух доменов с стволом, а также с доменом димеризации C-терминала. JDPs с N-терминал J-домен и глицин-фенилаланин богатый регион, но не хватает ЗФЛР, попадают в класс B. В целом, члены этих двух классов участвуют в сопровождающих функций. Члены, подпадающие под catchall класса C, который содержит JDPs, которые разделяют только J-домен4, набирать Hsp70s для выполнения различных функций, не связанных с сопровождающим. Важная роль JDPs как взаимозаменяемого распознавания субстрата “адапторы” системы Hsp70 находит свое отражение в расширении членов семьи в процессе эволюции. Например, люди имеют более 42 различных членов JDP4. Эти JDPs функции мономеров, гомодимеры и / или гомо / гетеро олигомеров4,5. В последнее время функциональное сотрудничество через переходное комплексное образование между классом А (например, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) и класс B (например, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotic JDPs, как сообщается, способствует эффективному распознаванию аморфных белковых агрегатов in vitro7,8. Эти комплексы смешанного класса JDP предположительно собираются на поверхности агрегированных белков для облегчения образования Hsp70- и Hsp70-Hsp100-протеиновых дезагрегаз7,8,9, 10. Критические доказательства в поддержку существования этих переходно сформированных смешанных комплексов JDP в эукариотических клетках были предоставлены PLA8.
НОАК все чаще используется для оценки белковых взаимодействий в метазоах, в первую очередь в клетках млекопитающих. Здесь мы сообщаем об успешном расширении этой техники для мониторинга переходно сформированных комплексов сопровождающего в эукариотических и прокариотических одноклеточных организмах, таких как подающий надежды дрожжи S. cerevisiae и бактерия E. coli. Важно отметить, что это расширение подчеркивает потенциальное использование НОАК в обнаружении и анализе микробов, которые инфицируют клетки человека и животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
В качестве давних методов для характеристики белковых сборок использовались подходы, основанные на социопротеии и локализации. Обнаружение переходно сформированных конкретных комплексов сопровождающего является серьезной проблемой при таких традиционных методах, и в результате пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NBN поддерживается специальным грантом на набор персонала из Университета Монаш факультета медицины медсестер и медицинских наук при финансировании со стороны правительства штата Виктория и австралийского правительства. Мы благодарим Бернда Букау (МБХ, Гейдельбергский университет, Германия) и Харм Х. Кампинга (Департамент биомедицинских наук клеток и систем, Университет Гронингена, Нидерланды) за их неоценимую поддержку и обмен реагентами, Хольгер Лоренц (КмБХ) Imaging Facility, Гейдельбергский университет, Германия) за поддержку с конфокальной микроскопии и обработки изображений, и Клэр Херст (ARMI, Университет Монаша, Австралия) для критического чтения рукописи.
Materials
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
References
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
