使用噬菌体显示肽库筛选和识别针对纤维细胞生长因子受体2的小肽

Summary

在此，我们提出了使用噬菌体显示肽库筛选与 FGFR2 结合的小肽的详细方案。我们进一步分析了所选肽在体外对FGFR2的亲和力及其抑制细胞增殖的能力。

Abstract

人类纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族由四个成员组成，即FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4，它们参与各种生物活动，包括细胞增殖、存活、迁移和分化。由于突变或基因扩增事件，FGFR信号通路中的几个畸变在不同类型的癌症中被识别出来。因此，最近的研究侧重于开发涉及FGFRs治疗靶向的策略。 目前在临床前和临床开发的不同阶段，目前的FGFR抑制剂包括酪氨酸激酶的小分子抑制剂或单克隆抗体，管道中只有几种肽抑制剂。在这里，我们提供了一个协议，使用噬菌体显示技术来筛选小肽作为FGFR2的拮抗剂。简单地说，在涂有FGFR2的板中孵育出一个噬菌体显示肽库。随后，未结合的噬菌体被TBST（TBS = 0.1%[v/v]补间-20）洗掉，并结合噬菌体用0.2M甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.2）洗净。洗脱的噬菌体被进一步放大，并用作下一轮生物泛化的输入。经过三轮生物盘分，通过DNA测序确定了单个噬菌体克隆的肽序列。最后，对筛选的肽进行合成，分析亲和力和生物活性。

Introduction

纤维细胞生长因子受体（FGFRs）在细胞增殖、伤口愈合和体内血管生成中起着^{关键作用。}在各种^{肿瘤2、3、4、5}中观察到的FGFR信号异常激活包括基因扩增、基因突变、染色体畸变和过量配体分^泌6.许多针对FGFRs的抑制剂在临床试验中显示出有希望的治疗效果，主要分为三类：（1）小分子激酶抑制剂，它与FGFR的细胞内域结合，（2）针对细胞外段和（3）FGF配体^陷阱6。虽然几种小分子激酶抑制剂在体外和体内均具有良好的治疗效果，但大部分靶点特异性较差，并表现出^高血压8等不良反应。大多数拮抗剂是单克隆^抗体9、10和多^肽11。肽具有比小分子的优势，由于其特异性和较低的副作用。与蛋白质^药物12相比，它们还保留了细胞渗透性，不会在特定器官中积累。因此，靶向小肽是有效和前瞻性的治疗剂。

噬菌体显示技术是一个简单但强大的工具，用于识别小肽，它可以结合到给定的分子13，14，15。我们使用一个噬菌体显示肽库，它基于一个简单的M13噬菌体，在尾部显示超过10⁹个不同的肽序列，以便与目标分子结合（见材料表）16。由于噬菌体对给定分子的亲和力高，未结合的噬菌体可以被冲走，并且只保留与所需短肽紧密结合的噬菌体。给定的分子靶点可以固定^{蛋白质17，18，}碳水化合物，培养细胞，甚至无机^{材料19，20。}一个令人兴奋的案例是，使用噬菌体显示^技术21在体内选择器官特异性肽。噬菌体显示技术的优点包括高通量、易操作性、低成本和广泛的^应用22。

在这项研究中，我们使用噬菌体显示库提供了筛选与固定蛋白（FGFR2）结合的小肽的详细方案。通过测量通过同质滴度测定仪（ITC）获得的肽对FGFR2的亲和力，以及通过细胞增殖测定的生物活性，也检查了该技术的疗效。该方法可以扩展用于筛选与碳水化合物、培养细胞甚至无机材料结合的小肽。

Protocol

1. 试剂制备 LB（溶菌肉汤）介质：在H2O高压灭菌剂100 mL中溶解1克胰腺酮、0.5克酵母提取物和0.5克NaCl，并储存在4°C处。 四环素库存：在1：1乙醇中制备20mg/mL：H2O.在-20°C储存，并在使用前涡流。 IPTG/X-gal 溶液：将 0.5 g 的 IPTG（二丙基 β-D-1-硫丙酮）和 0.4 g X-gal（5-溴-4-氯-3-indolyl β-D-角质苷）混合在 10 mL 的 DMF（二甲基甲酰胺）中。溶液可在黑暗中在-20°C下储存…

Representative Results

获得针对FGFR2的高亲和力小肽。 为了筛选针对FGFR2的噬菌体，本研究使用了一个Ph.D.-7库。工作流的原理图表示形式如图1所示。在此过程中，噬菌体输入（PFU）的数量保持不变，而FGFR2蛋白的涂层浓度逐渐降低。噬菌体命名结果表明，恢复的噬菌体数量逐渐增加，3轮后，与第一轮相比增加了65倍（表1）。 接?…

Discussion

组合噬菌体库是一种强大而有效的工具，用于高通量筛选新型肽，这种肽可以结合目标分子并调节其^功能13。目前，噬菌体显示肽库有着广泛的应用。例如，它们可用于选择与受体^{蛋白23结合的生物活性肽23、}非蛋白靶^{点24、25、}疾病特异性抗原^模仿13、细胞特异性^肽26、<sup cl…

Materials

0.22 μm Filter	Merck Millipore	MPGP002A1
35 cm2 Small dish	Thermo	150460
70% Ethanol	Guangzhou chemical reagent factory	64-17-5
-96 gIII sequencing primer			Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
96-well plate	Nest	701001-2
Agar	Beyotime	ST004D
Bacto-Tryptone	Oxoid	L0037
BALB/c 3T3 cells	ATCC	CRL-­6587
BSA	Biodragon	BD-M10110
CCK-8 kit	DOJINDO	CK04
DMEM	Hyclone	sh30243.01
DMF	Newprobe	PB10247
EDTA	Invitrogen	15576028
FGF2 Protein	Sino Biological Inc.	10014-HNAE	Purity >95%
Glycine	Sigma	G8898-1KG
IPTG	Beyotime	ST097
ITC200 system	MicroCal Omega
NaCl	Sigma	S6191
NaHCO3	Guangzhou chemical reagent factory	144-55-8
NaI	Bidepharm	BD40879
NaOH	Guangzhou chemical reagent factory	1310-73-2
PEG–8000	Sigma	P2139-250
Ph.D.-7 phage display peptide library kit	New England BioLabs	E8100S	Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage
Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins	Sino Biological Inc.	10824-H08H	Purity > 97%
Small peptide			Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)
Tetracycline	Sigma	S-SHS-5
Tris	Sigma	SLF-T1503
Tween-20	Beyotime	ST825
X-gal	Beyotime	ST912
Yeast extract	Oxoid	LP0021