הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים
Summary
כאן, אנו מתארים את הסינתזה של ליפוזומים בסמים שנטענו וההזרקה שלהם לזחל הדגים מטרה למטרה לכוון מסירת סמים לתאי השושלת מקרופאג.
Abstract
Zebrafish (danio rerio) הזחלים התפתחו למודל פופולרי לחקור אינטראקציות מארח הפתוגן והתרומה של תאים חיסוניים מולדים למחלות דלקתיות בשל המערכת החיסונית שלהם שימור פונקציונלית מולדים. הם גם משמשים רבות כדי לבחון כיצד תאים חיסוניים מולדים לסייע להדריך תהליכים התפתחותיים. על-ידי ניצול השקיפות האופטית ואת השיטות הגנטיות של זחל צברפיש, מחקרים אלה מתמקדים לעתים קרובות על גישות הדמיה חיה לאפיין פונקציונלי מסומנים פלואורוסקופים ונויטרופילים בתוך בעלי חיים שלמים. בשל טרוגניות תפקודית מגוונת שלהם והרחבת תפקידים בפתוגנזה המחלה, מקרופאגים קיבלו תשומת לב משמעותית. בנוסף למניפולציות גנטיות, התערבויות כימיות משמשות כעת באופן שגרתי כדי לתמרן ולבחון התנהגות מקרופאג בזחל מדגים. מסירת תרופות אלה מוגבלת בדרך כלל למיקוד פסיבי של תרופה חופשית באמצעות טבילה ישירה או מיקרוהזרקה. גישות אלה מסתמכות על ההנחה כי כל שינוי התנהגות מקרופאג הם תוצאה של השפעה ישירה של הסם על מקרופאגים עצמם, ולא תוצאה במורד הזרם של השפעה ישירה על סוג תא אחר. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים שלנו במטרה לכוון תרופות במיוחד לזחל מקרופאגים באמצעות מיקרוהזרקת סמים שנטענו ליפוזומים. אנו חושפים כי poloxamer 188-שונה ליפוזומים לתרופות פלורסנט כחול הם נלקח בקלות על ידי מקרופאגים, ולא על ידי נויטרופילים. כמו כן, אנו מספקים ראיות לכך שסמים הנמסרים בדרך זו יכולים להשפיע על מקרופאג פעילות באופן עקבי עם מנגנון פעולת התרופה. טכניקה זו יהיה ערך לחוקרים המבקשים להבטיח המיקוד של תרופות מקרופאגים וכאשר הסמים רעילים מדי כדי להיגאל על ידי שיטות מסורתיות כמו טבילה.
Introduction
מערכת פגוציט מספק קו ההגנה הראשון נגד הפולשים פתוגנים. מערכת זו מורכבת מונוציטים, תאים דנדריטים מונוציט נגזר ו מקרופאגים, אשר באופן פעיל phagocytoze פתוגנים זרים, ובכך להגביל את התפשטות הפתוגן. בנוסף לפונקציות אלה phagocytic ו microbicidal התאים הדנדריטים מקרופאגים הם גם מסוגלים ייצור cy, אנטיגן-מצגת כדי להפעיל את המערכת החיסונית אדפטיבית1. של תאים אלה, מקרופאגים קיבלו תשומת לב מיוחדת בשל טרוגניות תפקודית מגוונת שלהם ומעורבות מחלות דלקתיות מרובות, מ חסינות אוטומטית מחלות זיהומיות לסרטן2,3,4,5,6,7. הפלסטיות של מקרופאגים ויכולתם להסתגל מבחינה פונקציונלית לצרכים בסביבת הרקמה שלהם מחייבת גישות נסיוניות להתבונן ישירות ולחקור תאים אלה בvivo.
זחל זהפיש הם אורגניזם מודל אידיאלי שדרכו ללמוד את הפונקציה ואת הפלסטיות של מקרופאגים ב vivo8. השקיפות האופטית של זחל דג זברה מספק חלון כדי להתבונן ישירות התנהגות של מקרופאגים, במיוחד כאשר ביחד עם קווי הכתב הטרנסגניים מקרופאג. ניצול פוטנציאל ההדמיה החי ואת היכולת הניסיונית של זחל הדגים הובילו לתובנות משמעותיות רבות לפונקציה מקרופאג שיש להן רלוונטיות ישירה למחלה האנושית9,10,11,12,13,14,15. רבים ממחקרים אלה ניצלו גם את היתרון של שימור גבוה של פעילות הסמים ב-דג זברה (תכונה המסופינים השימוש שלהם בתור בעלי חיים לגילוי התרופה שלמה16,17,18), על ידי ניצול התערבויות כימיות כדי פרמקולוגית לטפל מקרופאג פונקציה. עד כה, טיפולים תרופתי אלה נמסרו בעיקר באמצעות טבילה, אשר דורש את הסם להיות מסיסים במים, או על ידי מיקרוהזרקה ישירה של תרופה חופשית (איור 1א). מגבלות אלה אסטרטגיות מסירה פסיבית כוללים אפקטים מחוץ ליעד ורעילות כללית העלולה למנוע הערכה כל השפעה על מקרופאג function. בנוסף, כאשר חקירת תופעות התרופה על מקרופאגים זה לא ידוע אם הסמים פועלים על מקרופאגים עצמם או באמצעות מנגנונים עקיפים יותר. בעת ביצוע התערבות כימית דומה במחקרים לחקור פונקציה מקרופאג, הכרנו היה צורך לא מוכר לפתח שיטת משלוח זולה וישירה כדי למקד את התרופות במיוחד מקרופאגים.
ליפוזומים הינם מיקרוסקופיים, ביולוגיים, בעלי שומנים מיקרוסקופים, שיכולים לכמס חלבונים, נוקלאוטידים ומטענים של סמים19. מבנה השומנים הunilamellar או רב-לאמצ’יני במבנה של ליפוזומים מהווה לומן פנימי מימית שבו ניתן לשלב תרופות מסיסים במים בעוד תרופות הידרופובי ניתן לשלב בקרומים השומנים. בנוסף, המאפיינים הפיזיקליים של ליפוזומים, כולל גודל, חיוב ושינויי פני שטח ניתן לתמרן כדי להתאים את המיקוד שלהם לתאים ספציפיים20,21. תכונות אלה של ליפוזומים עשו להם רכב אטרקטיבי לספק סמים ולשפר את הדיוק של הטיפול הנוכחי משטרי20. כמו ליפוזומים הם באופן טבעי phagocytozed על ידי מקרופאגים (תכונה מנוצלת על ידי שימוש שגרתי שלהם באספקת clodronate במיוחד מקרופאגים עבור ניסויים אבלציה22), הם מציגים כאופציה אטרקטיבית עבור משלוח סמים ספציפי מקרופאג (איור 1B).
פרוטוקול זה מתאר את הניסוח של תרופות ליפוזומים כחול פלורסנט מצופה עם הידרופילי פולימר poloxamer 188, כי צורות שכבת הגנה על ליפוכמה משטח והוכח כדי לשפר את שמירת הסמים יש ביולוגי מעולה23. Poloxamer נבחרה לציפוי פני השטח של ליפוזומים כמו המחקר הקודם שלנו הראו כי, כאשר לעומת פוליאתילן גליקול שונה ליפוזומים, poloxamer שונה ליפוזומים הראה תאימות ביולוגית טובה יותר בעקבות הזרקה תת עורית של כפות הראש ואת פרמקוקינטיקה דומה בארנבים בעקבות עירוי אינפוזיה23. הפרוטוקולים מתוארים גם עבור המיקרו ההזרקה שלהם לתוך זחל הדמיה חיה להעריך את היכולת המקרופאג שלהם ולוקליזציה לתאים תאיים הנחוצים ליפוכמה השפלה ומשלוח תרופות cytoplasmic. כהוכחה-of-קונספט בעבר השתמשנו בטכניקה זו כדי למקד שתי תרופות מקרופאגים כדי לדכא את ההפעלה שלהם במודל זחל דג זברה של דלקת gouty חריפה24. טכניקה זו מסירת סמים מרחיבה את “ערכת הכלים” הכימית הזמינה לחוקרי דג זברה המבקשים להבטיח מקרופאג-פילוח של תרופות הריבית שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, סיפקנו פרוטוקול מפורט כדי לנסח ליפוזומים בסמים שנטענו למטרה במיוחד מקרופאגים בזחל החוצה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לנתח את התפקיד של מקרופאגים במודלים של מחלות מסוימות על ידי הבטחת מסירת ממוקדות ישירה של תרופות במיוחד מקרופאגים. כמו-כן, ניתן להשתמש בה כאשר רעילות כללית של סמים מגבילה את …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שהוענקו C.J.H. (בריאות המועצה של ניו זילנד וקרן מרסדן, החברה המלכותית של ניו זילנד) ו Z.W. (קרן הפקולטה לפיתוח מחקר מאוניברסיטת אוקלנד). המחברים מודים alhad מהפך מהאגקאר עבור ניהול מומחה של מתקן דג זברה, יחידת הדמיה ביו-רפואית, בית הספר למדעי הרפואה, אוניברסיטת אוקלנד לסיוע עם הדמיה קונפוקלית וקד ו גרהם lieschke עבור gifting של Tg (mpeg1: egfp) כתב קו.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
References
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers–liposomes and microspheres–on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
