从果蝇雄性附件腺的二级细胞中分离RNA的FACS协议
Summary
在这里，我们提出一个协议，从果蝇雄性附属腺体（辅助细胞）分离和排序特定细胞群，用于RNA测序和RT-qPCR。细胞分离是通过FACS纯化GFP表达的二次细胞后，需要解剖，蛋白酶消化和机械分散多步骤解散过程。
Abstract
为了理解器官的功能，理解其组成细胞群的作用通常很有用。不幸的是，单个细胞群的稀有性往往使得很难获得足够的材料用于分子研究。例如，果蝇雄性生殖系统的附属腺体包含两种截然不同的分泌细胞类型。主细胞占腺体分泌细胞的96%，而次级细胞（SC）占细胞的其余4%（每个男性约80个细胞）。虽然这两种细胞类型都产生的重要成分，但已知只有少数基因是 SC 特有的。到目前为止，SC的稀有性阻碍了这一重要细胞类型的转录组分析研究。这里提出了一种方法，允许纯化用于RNA提取和测序的SC。该协议包括首先从苍蝇中解剖腺体，表达SC特异性GFP报告器，然后将这些腺体置于蛋白酶消化和机械分离中，以获得单个细胞。按照这些步骤，使用荧光活细胞分拣机（FACS）对单个、活体、GFP标记的细胞进行分类，用于RNA纯化。此程序产生 SC 特异性 RNA 从 +40 男性每个条件在一天内的下游RT-qPCR和/或RNA测序。程序的快速性和简单性允许从不同的基因型或环境条件，在短时间内确定许多不同的苍蝇的转录。
Introduction
器官由多种细胞类型组成，每种细胞类型都有离散功能，有时表达的基因组非常不同。为了准确理解器官的功能，研究组成这个器官的每种不同的细胞类型通常是至关重要的。用于探索可能功能的主要方法之一是转录子分析。这种强大的方法提供了细胞中基因表达的快照，以揭示活跃的过程和途径。然而，对于必须从更丰富的相邻细胞中纯化的稀有细胞群来说，这种类型的分析通常是困难的。例如，果蝇男性附属腺体是主要由两种分泌细胞类型组成的器官。由于两种细胞类型的稀有细胞只占该腺体细胞的4%，因此没有使用细胞类型特定的转录组分析来帮助确定这些细胞的功能。
附属腺体（AGs）是昆虫中男性生殖道的器官。它们负责生产的大部分蛋白质（蛋白（ SFPs ）和附属腺蛋白（ ACPs ）。其中一些SFP已知诱导交配雌性生理和行为反应，通常称为交配后反应（PMR）。一些PmR包括：排卵率和卵子产卵率增加，精子的储存和释放，女性饮食的变化，以及女性对二级求亲男性1，2的接受率下降。由于昆虫影响到从人类健康（作为致命疾病的载体）到农业的许多重大社会问题（昆虫可以是害虫，但对授粉和土壤质量至关重要），了解昆虫繁殖是一个重要的研究领域。与模型有机体果蝇黑色素酶一起，对GS和ACPs的研究有了显著进展。这些研究强调了AGs和它们产生的一些单个蛋白质在创建PMR中的作用，影响了其他物种的工作，如病媒伊蚊3、4和其他昆虫1 ， 5.此外，当AG分泌精液1，6的成分时，它们通常被认为是哺乳动物前列腺和精质囊泡的功能模拟。这种功能相似性结合两个组织类型的分子相似性，使AGs成为苍蝇7前列腺的模型。
在果蝇雄性，有两个附属腺叶。每个叶可以被看作是一个囊状结构，由围绕中央流明的单层分泌细胞组成，由光滑的肌肉包裹。如上所述，有两种形态、发育和功能上截然不同的分泌细胞类型组成这个腺体：多边形主细胞（占细胞的96%），以及较大的圆形二次细胞（SC）（组成剩余的4%的细胞，或大约40个细胞每叶）。已经表明，两种细胞类型产生不同的ASP集，以诱导和维持PMR。迄今为止获得的大部分数据都强调了单一蛋白质在触发PMR大多数特征行为中的作用。这种蛋白质，性肽，是一种小的，36个氨基酸肽，由主细胞8，9，10分泌。虽然性肽似乎在PMR中起主要作用，但主细胞和继发细胞产生的其他AcPs也已被证明影响PMR11、12、13、14的各个方面。 ，15，16，17.例如，根据我们目前的知识，SC，通过它们产生的蛋白质，似乎需要在第一天18日之后使SP信号永久化。
鉴于SCs的稀有性（每只男性只有80个细胞），我们关于这些细胞及其产生的蛋白质的所有知识都来自遗传学和候选方法。到目前为止，只有相对较少的基因列表被证明是SC特异性的。此列表包括地域蛋白缺陷已验证的三叶草 （Dve）19，lncRNA MSA20， Rab6， 7， 11和1921， CG1656和CG1757511， 15，21和主箱转录因子腹 – B （Abd-B）18.以前，我们已经表明，在二次细胞（iab-6cocuD1突变体）中，Abd-B和lncRNA MSA的表达存在突变缺陷，将PMR的长度从+10天缩短到只有一天12,18,20.这种表型似乎是由于SP在女性生殖道12、18、20中储存不当所致。在细胞水平上，这种突变体的次生细胞表现出异常形态，失去其特有的真空状结构18，20，21。使用这种突变线，我们以前试图通过比较来自野生类型或突变附件腺体12的整个GS的转录配置文件来识别涉及SC功能的基因。此外，其他实验室显示，SC数，形态和真空含量取决于男性的饮食，交配状态和年龄21，25，26。
虽然这些方法取得了积极进展，但SC全文远未实现。这些细胞在这个器官中的稀有性使得即使从野生型细胞也很难进一步进步。对于测试基因表达，这些细胞在特定环境刺激后的变化将更加困难。因此，需要一种分离和纯化SC RNA的方法，该方法足够快速和简单，足以在不同的遗传背景和环境条件下发挥作用。
Abd-B和MSA基因都需要从果蝇Bithorax复合物（称为D1增强剂）的特异性1.1kb增强剂，以在SCs18，20中表达。此增强剂以前曾用于创建GAL4驱动程序，当该驱动程序与UAS-GFP关联时，能够专门在 SC 中驱动强大的 GFP 表达式。因此，我们使用此行作为 FACS 协议的基础，将这些细胞从野生类型和iab-6cocuD1 AGs 中分离。由于iab-6cocuD1突变S显示不同的细胞形态，我们表明，该协议可用于分离细胞，以确定其转录组从这种罕见的细胞类型在完全不同的条件下。
Protocol
Representative Results
Discussion
细胞分离的方法从果蝇组织，如象形圆盘已经描述了23。我们试图简单地在附属腺体上使用这些程序失败，鼓励我们开发这种新协议。蛋白酶消化和机械三聚酯是我们为手术成功而烦恼的关键步骤，因此，我们在第2至第5节中放置了许多注释，以帮助实验者获得令人满意的结果。为了解脱成功，肽类细胞必须到达附属腺细胞，这些细胞受流明体中的粘性和腺体周围的肌肉层…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Karch实验室的成员，感谢iGE3基因组学板块，感谢日内瓦大学的流式细胞学核心设施，感谢为FACS制定协议的让-皮埃尔·奥布里-拉查纳耶博士。我们感谢卢卡·斯蒂克利帮助可视化IGV上的阅读。我们感谢自己温柔地允许重用数字，感谢编辑们促使我们在写作方面富有创造性。
这项研究由日内瓦州（CI、RKM、FK）、瑞士国家研究基金（www.snf.ch）和克拉拉兹基金会（FK）捐款资助。
Materials
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μl graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μl bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
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