Drosophila Erkek Aksesuar Bezlerinin Sekonder Hücrelerinden RNA'yı Izole etmek için FACS tabanlı Protokol
Summary
Burada, RNA dizilimi ve RT-qPCR için Drosophila erkek aksesuar bezlerinden (ikincil hücreler) belirli bir hücre popülasyonunu ayrıştırmak ve sıralamak için bir protokol sıyoruz. Hücre izolasyonu, diseksiyon gerektiren çok aşamalı bir ayrışma sürecinden sonra GFP ifade eden ikincil hücrelerin FACS saflaştırılması ile gerçekleştirilir, proteozs sindirim ve mekanik dağılım.
Abstract
Bir organın işlevini anlamak için, genellikle kurucu hücre popülasyonlarının rolünü anlamak yararlıdır. Ne yazık ki, bireysel hücre popülasyonlarının nadirlik genellikle zor moleküler çalışmalar için yeterli malzeme elde etmek için yapar. Örneğin, Drosophila erkek üreme sisteminin aksesuar bezi iki farklı salgı hücre tipleri içerir. Ana hücreler bezin salgı hücrelerinin %96’sını oluştururken, ikincil hücreler (SC) hücrelerin kalan %4’ünü (erkek başına yaklaşık 80 hücre) oluşturur. Her iki hücre tipi de meni sıvısının önemli bileşenlerini üretse de, sadece birkaç genin SC’lere özgü olduğu bilinmektedir. SCs nadir, şimdiye kadar, bu önemli hücre tipinin transkripsiyonanalizi çalışma engelledi. Burada, RNA çıkarma ve sıralama için SCs saflaştırma sağlayan bir yöntem sunulmaktadır. Protokol, sc’ye özgü gfp muhabirini ifade eden sineklerin bezlerini ilk olarak incelemekten ve daha sonra bu bezleri sindirimi ve mekanik ayrışmayı tek tek hücreler elde etmek için proteaz etmek için maruz bırakmaktan oluşur. Bu adımları takiben, bireysel, canlı, GFP işaretli hücreler RNA arınması için floresan aktif hücre ayırıcı (FACS) kullanılarak sıralanır. Bu işlem, bir gün içinde aşağı RT-qPCR ve/veya RNA dizilimi için koşul başına ~40 erkekten SC’ye özgü RNA’lar verir. Prosedürün hızı ve basitliği, farklı genotiplerden veya çevre koşullarından birçok farklı sineğin transkriptomlarının kısa sürede belirlenmesini sağlar.
Introduction
Organlar, her biri ayrı ayrı işlevlere sahip ve bazen çok farklı gen kümelerini ifade eden birden fazla hücre tipinden oluşur. Bir organın nasıl işlediğini tam olarak anlamak için, bu organı oluşturan her farklı hücre türünü incelemek genellikle önemlidir. Olası fonksiyonu araştırmak için kullanılan birincil yöntemlerden biri transkriptom analizidir. Bu güçlü yöntem, aktif süreçleri ve yolları ortaya çıkarmak için, bir hücredeki gen ekspresyonunun anlık görüntüsünü sağlar. Ancak, bu tür analizler genellikle çok daha bol komşu hücrelerden arındırılmış olması gereken nadir hücre popülasyonları için zordur. Örneğin, Drosophila erkek aksesuar bezi öncelikle iki salgı hücre tiplerinden oluşan bir organdır. Bu iki hücre tipinin nadiri bu bezin hücrelerinin sadece %4’ünü oluşturduğundan, bu hücrelerin işlevini belirlemeye yardımcı olmak için hücre tipi spesifik transkripsiyon analizi kullanılmamıştır.
Aksesuar bezleri (AGs) böceklerde erkek üreme yolu organlarıdır. Meni sıvısı (seminal sıvı proteinleri (SP) ve aksesuar bezi proteinleri (PSEP) proteinlerinin çoğunun üretiminden sorumludurlar. Bu SP’lerden bazılarının çiftleşme sonrası çiftleşme yanıtı (PMR) olarak adlandırılan çiftleşmeli kadınlarda fizyolojik ve davranışsal tepkileri tetiklemeleri bilinmektedir. Bazı PmR şunlardır: artan yumurtlama ve yumurta döşeme oranı, depolama ve sperm serbest bırakılması, kadın diyetbir değişiklik, ve ikincil kur erkeklere kadın alıcılık bir azalma1,2. Böcekler insan sağlığından (ölümcül hastalıklar için vektörler olarak) tarıma (böcekler zararlı olabilir, ancak tozlaşma ve toprak kalitesi için kritik tir) gibi birçok önemli toplumsal sorunları etkilediğinden, böcek üremesinin anlaşılması önemli bir araştırma alanıdır. AGs ve PPS çalışma model organizma Drosophila melanogaster ile önemli ölçüde ilerletilmiştir. Bu çalışmalar, Hastalık vektörü Aedes aegypti3,4ve diğer böcekler 1 gibi diğer türlerde çalışmayı etkileyen, PMR oluştururken ürettikleri AG’lerin ve bazı bireysel proteinlerin rolünü vurgulamıştır. ,5. Ayrıca, AGs meni sıvısı bileşenleri salgılar gibi1,6 genellikle memeli prostat bezi ve seminal vezikül fonksiyonel analog olarak düşünülmektedir. Bu fonksiyon benzerliği iki doku tipi arasındaki moleküler benzerlikler ile birlikte, AGs sinekler prostat bezi için bir model yaptık7.
Drosophila erkek içinde, aksesuar bezleri iki loblar vardır. Her lob merkezi bir lümen çevreleyen salgı hücrelerinin bir monolayer oluşan bir kese benzeri bir yapı olarak görülebilir, ve düz kaslar tarafından sarılmış. Yukarıda belirtildiği gibi, bu bezi oluşturan iki morfolojik, gelişimsel ve işlevsel olarak farklı salgı hücre tipleri vardır: poligonal şekilli ana hücreler (hücrelerin ~% 96’sını oluşturan) ve daha büyük, yuvarlak ikincil hücreler (SC) (oluşturan hücrelerin kalan% 4, ya da lob başına yaklaşık 40 hücre). Her iki hücre türünün de PMR’yi ikna etmek ve korumak için farklı AcP kümeleri ürettiği gösterilmiştir. Bugüne kadar elde edilen verilerin çoğu PMR karakteristik davranışlarının çoğunu tetikleyen tek bir proteinin rolünü vurgulamaktadır. Bu protein, cinsiyet peptid, ana hücreleri tarafından salgılanan küçük, 36 amino asit peptid8,9,10. Seks peptid PMR önemli bir rol oynamak gibi görünse de, diğer AcPs, hem ana hem de ikincil hücreler tarafından üretilen, ayrıca PMR çeşitli yönlerini etkilediği gösterilmiştir11,12,13,14 ,15,16,17. Örneğin, mevcut bilgidayanarak, SCs, ürettikleri proteinler aracılığıyla, ilk gün18sonra SP sinyal sürekliliği için gerekli gibi görünüyor.
SCs nadir göz önüne alındığında (erkek başına sadece 80 hücre), bu hücreler ve ürettikleri proteinler hakkında tüm bilgi genetik ve aday yaklaşımlar geliyor. Şimdiye kadar, genlerin sadece nispeten küçük bir liste SC özgü olduğu gösterilmiştir. Bu liste homeodomain protein Defective proventriculus içerir (Dve)19, lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 ve 1921, CG1656 ve CG1757511, 15,21 ve homeobox transkripsiyon faktörü Abdominal-B (Abd-B)18. Daha önce, ikincil hücrelerde Abd-B ve lncRNA MSA ifadesiiçin bir mutant eksikliği göstermiştir ~10 gün sadece bir gün12 PMR süresini kısaltır , 18.000 , 20. Bu fenotip kadın üreme sisteminde SP uygunsuz depolama neden gibi görünüyor12,18,20. Hücresel düzeyde, Bu mutant ikincil hücreler anormal morfoloji sevesi, karakteristik vakuol benzeri yapıları kaybetme18,20,21. Bu mutant hattı kullanarak, daha önce ya vahşi tip veya mutant aksesuar bezleri12tüm AGs transkripsiyonel profilleri karşılaştırarak SC fonksiyonu dahil genleri tanımlamak için çalıştı. Ayrıca, diğer laboratuvarlar SC numarası, morfolojisi ve vakuolar içerik erkek diyet, çiftleme durumu ve yaş21,25,26bağlıdır gösterdi .
Bu yaklaşımlar kullanılarak olumlu ilerleme kaydedilen rağmen, tam bir SC transkripsiyonu elde edilemedi. Bu organdaki bu hücrelerin nadirliği, yabani tip hücrelerden daha da ilerlemesini zorlaştırdı. Gen ekspresyonunu test etmek için, belirli çevresel uyaranlardan sonra bu hücrelerdeki değişiklikler daha da zor olacaktır. Böylece, farklı genetik arka planlar ve çevre koşulları altında gerçekleştirmek için yeterince hızlı ve basit olan SC RNA’yı izole etmek ve arındırmak için bir yönteme ihtiyaç duyuldu.
Hem Abd-B ve MSA genleri Drosophila Bithorax Kompleksi belirli bir 1.1 kb arttırıcı gerektirir (D1 arttırıcı denir) SCs kendi ifade için18,20. Bu artırıcı daha önce bir GAL4 sürücüsü oluşturmak için kullanılmıştır, bir UAS-GFPile ilişkili olduğunda , Özellikle SCs güçlü GFP ifade sürücü yapabiliyor. Böylece, bu hücreleri hem vahşi tipten hem de iab-6cocuD1 AĞ’larından ayırmak için bir FACS protokolünün temeli olarak bu satırı kullandık). iab-6cocuD1 mutant SC’leri farklı bir hücresel morfoloji sergilediklerinden, bu protokolün çok farklı koşullar altında bu nadir hücre tipinden transkripsiyonlarının belirlenmesi için hücreleri izole etmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hayali diskler gibi Drosophila dokusundan hücre ayrıştırma yöntemleri zaten23açıklanmıştır . Bu prosedürleri aksesuar bezleri üzerinde kullanma girişimlerimiz başarısız oldu ve bu yeni protokolü geliştirmemiz için bizi cesaretlendirdi. Proteaz sindirim ve mekanik triturasyon biz prosedürün başarısı için sorun shot kritik adımlar vardı, ve böylece deneyciler tatmin edici sonuçlar elde etmek için yardımcı olmak için bölüm 2-5 birçok notlar yerleştirilir….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Karch laboratuvarı üyelerine, iGE3 genomik plaka formuna, Cenevre Üniversitesi’nin Flow Cytometry çekirdek tesisine ve FACS protokolünü belirleyen Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye’ye minnettarız. Luca Stickley’e IGV’deki okumaları görselleştirmedeki yardımları için teşekkür ederiz. Biz rakamlar yeniden kullanmak için nazik izni için kendimize teşekkür ederiz, ve editörler bize yazma ile yaratıcı olmak isteyen için.
Bu araştırma Cenevre Eyaleti (CI, RKM, FK), İsviçre Ulusal Araştırma Fonu (www.snf.ch) (FK ve RKM) ve Claraz Vakfı’nın (FK) bağışları tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μl graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μl bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
