Een op FACS gebaseerd protocol om RNA te isoleren van de secundaire cellen van de mannelijke Accessoireklieren van Drosophila
Summary
Hier presenteren we een protocol om een specifieke celpopulatie te ontkoppelen en te sorteren op de mannelijke accessoireklieren Drosophila (secundaire cellen) voor RNA-SEQUENCING en Rt-qPCR. Celisolatie wordt bereikt door middel van FACS zuivering van GFP-uitdrukken van secundaire cellen na een multistep dissociatie proces waarbij dissectie, proteasen spijsvertering en mechanische dispersie.
Abstract
Om de functie van een orgaan te begrijpen, is het vaak nuttig om de rol van de samenstellende celpopulaties te begrijpen. Helaas maakt de zeldzaamheid van individuele celpopulaties het vaak moeilijk om genoeg materiaal te verkrijgen voor moleculaire studies. De accessoireklier van het mannelijke voortplantingssysteem Drosophila bevat bijvoorbeeld twee verschillende secretoire celtypen. De belangrijkste cellen vormen 96% van de secretoire cellen van de klier, terwijl de secundaire cellen (SC) make-up van de resterende 4% van cellen (over 80 cellen per man). Hoewel beide celtypen belangrijke componenten van de zaadvloeistof produceren, is het bekend dat slechts een paar genen specifiek zijn voor de SCs. De zeldzaamheid van SCs heeft, tot nu toe, de Transcriptomic Analysis studie van dit belangrijke celtype belemmerd. Hier wordt een methode gepresenteerd die de zuivering van SCs voor RNA-extractie en-sequencing mogelijk maakt. Het protocol bestaat uit eerste dissectie klieren uit vliegen uitdrukken van een SC-specifieke GFP reporter en vervolgens het onderwerpen van deze klieren aan protease spijsvertering en mechanische dissociatie om individuele cellen te verkrijgen. Na deze stappen worden individuele, levende, GFP-gemarkeerde cellen gesorteerd met behulp van een fluorescerende geactiveerde celsorteerder (FACS) voor RNA-zuivering. Deze procedure levert SC-specifieke Rna’s van ~ 40 mannetjes per aandoening voor downstream RT-qPCR en/of RNA-sequencing in de loop van één dag. De snelheid en eenvoud van de procedure maakt het mogelijk voor de transcriptomes van veel verschillende vliegen, van verschillende genotypen of omgevingscondities, te bepalen in een korte periode van tijd.
Introduction
Organen bestaan uit meerdere celtypen, elk met discrete functies en soms sterk verschillende sets van genen uitdrukken. Om een precies inzicht te krijgen in hoe een orgaan functioneert, is het vaak essentieel om elk afzonderlijk celtype dat dit orgel vormt te bestuderen. Een van de belangrijkste methoden die worden gebruikt om de mogelijke functie te verkennen is transcriptome analyse. Deze krachtige methode biedt een momentopname van de genexpressie in een cel, om actieve processen en trajecten te onthullen. Echter, dit soort analyse is vaak moeilijk voor zeldzame celpopulaties die moeten worden gezuiverd van veel meer-overvloedige naburige cellen. De mannelijke accessoireklier Drosophila is bijvoorbeeld een orgaan dat voornamelijk uit twee secretoire celtypen bestaat. Aangezien de zeldzamer van de twee celtypen slechts 4% van de cellen van deze klier omvat, was het gebruik van een cel-type specifieke transcriptome-analyse niet gebruikt om de functie van deze cellen te helpen bepalen.
Accessoireklieren (AGs) zijn organen van het mannelijke voortplantingsstelsel bij insecten. Ze zijn verantwoordelijk voor de productie van de meeste eiwitten van de zaadvloeistof (zaadvloeistof eiwitten (Sfp’s) en accessoireklier proteïnen (Acp’s)). Sommige van deze Sfp’s zijn bekend voor het opwekken van de fysiologische en gedragsmatige reacties in gemuleerde vrouwtjes, vaak genoemd de post-paring reactie (PMR). Sommige van de PMRS omvatten: een verhoogde ovulatie en ei-leggen tarief, de opslag en afgifte van sperma, een verandering in het vrouwelijk dieet, en een afname van de ontvankelijkheid van de vrouwelijke aan secundaire hofmakerij mannetjes1,2. Omdat insecten veel belangrijke maatschappelijke kwesties van de menselijke gezondheid (als vectoren voor dodelijke ziekten) aan de landbouw beïnvloeden (insecten kunnen ongedierte zijn, maar toch kritisch zijn voor bestuiving en bodemkwaliteit), is het begrijpen van de reproductie van insecten een belangrijk onderzoeksgebied. De studie van AGs en ACPs is sterk gevorderd met het modelorganisme Drosophila melanogaster. Deze studies hebben de rol van AGs en enkele van de individuele eiwitten die zij produceren in het creëren van de PMR, beïnvloed het werk in andere soorten zoals de ziekte vector Aedes aegypti3,4, en andere insecten1 ,5. Bovendien, zoals AGs de bestanddelen van dezaadvloeistof scheiden,worden ze vaak gezien als de functionele analogon van de prostaat klier van zoogdieren en het zaadblaasje. Deze functie gelijkenis gecombineerd met moleculaire gelijkenissen tussen de twee weefsel-types, hebben de AGs een model voor de prostaat klier gemaakt in vliegen7.
Binnen het Drosophila mannetje zijn er twee lobben van accessoireklieren. Elke LOB kan worden gezien als een SAC-achtige structuur opgebouwd uit een monolaag van secretoire cellen rond een centraal lumen, en verpakt door gladde spieren. Zoals hierboven vermeld, zijn er twee morfologisch, ontwikkelmentaal en functioneel verschillende secretoire celtypen die deze klier vormen: de veelhoekige hoofd cellen (die ~ 96% van de cellen maken) en de grotere, ronde secundaire cellen (SC) (waaruit de resterende 4% van de cellen, of ongeveer 40 cellen per LOB). Het is aangetoond dat beide celtypen produceren verschillende sets van ACPs voor het opwekken en onderhouden van de PMR. De meeste van de tot nu toe verkregen gegevens wijzen op de rol van één enkel eiwit dat het grootste deel van het karakteristieke gedrag van de PMR activeert. Dit eiwit, de geslachts peptide, is een klein, 36 aminozuur peptide dat wordt uitgescheiden door de belangrijkste cellen8,9,10. Hoewel de geslachts peptide een belangrijke rol lijkt te spelen in de PMR, zijn andere acp’s, geproduceerd door zowel de hoofd-als de secundaire cellen, ook aangetoond dat ze invloed hebben op verschillende aspecten van de PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Op basis van onze huidige kennis lijken de SCs, via de eiwitten die ze produceren, bijvoorbeeld nodig te zijn voor de bestending van de SP-signalering na de eerste dag18.
Gezien de zeldzaamheid van de SCs (slechts 80 cellen per man), al onze kennis over deze cellen en de eiwitten die zij produceren komt uit genetica en kandidaatbenaderingen. Tot nu toe is slechts een relatief kleine lijst van genen aangetoond dat SC-specifiek is. Deze lijst bevat de homeodomain proteïne defecte proventriculus (DVE)19, de lncrna MSA20, Rab6, 7, 11 en 1921, CG1656 en CG1757511, 15,21 en de Homeobox transcriptiefactor abdominaal-b (Abd-b)18. Eerder hebben we aangetoond dat een mutant tekort voor zowel de uitdrukking van Abd-B als de lncRNA MSA in secundaire cellen (IAB-6cocuD1 Mutant) de lengte van de PMR verkort van ~ 10 dagen tot slechts één dag12 , 18 , 20. dit fenotype lijkt te zijn veroorzaakt door de onjuiste opslag van SP in het vrouwelijke voortplantingsstelsel12,18,20. Op cellulair niveau, de secundaire cellen van deze Mutant vertonen abnormale morfologie, het verliezen van hun karakteristieke vacuole-achtige structuren18,20,21. Met behulp van deze Mutant lijn hebben we eerder geprobeerd om genen te identificeren die betrokken zijn bij de SC functie door de transcriptionele profielen van Whole AGs te vergelijken van wild type of Mutant accessoireklieren12. Ook, andere Labs toonde aan dat SC nummer, morfologie en vacuole inhoud afhankelijk van mannelijke dieet, parings status en leeftijd21,25,26.
Hoewel er positieve vooruitgang werd geboekt met behulp van deze benaderingen, was een volledig SC transcriptome verre van gerealiseerd. De zeldzaamheid van deze cellen in dit orgel maakte het moeilijk om verder te vorderen, zelfs van wilde type cellen. Voor het testen van genexpressie zouden veranderingen in deze cellen na bepaalde milieu stimuli nog moeilijker zijn. Zo was er een methode nodig voor het isoleren en zuiveren van SC RNA dat snel en eenvoudig genoeg was om onder verschillende genetische achtergronden en omgevingsomstandigheden te presteren.
Zowel de Abd-B- als de MSA -genen vereisen een specifieke 1,1 KB Enhancer van het Drosophila bithorax complex (de D1 Enhancer genoemd) voor hun expressie in SCs18,20. Deze versterker is eerder gebruikt voor het maken van een GAL4 driver die, wanneer gekoppeld aan een UAS-GFP, is in staat om sterke GFP expressie specifiek in SCs rijden. Zo gebruikten we deze lijn als basis voor een FACS-protocol om deze cellen te isoleren van zowel wild type als IAB-6cocuD1 AGs). Omdat IAB-6CocuD1 Mutant SCs een andere cellulaire morfologie weergeeft, tonen we aan dat dit protocol kan worden gebruikt om cellen te isoleren voor de bepaling van hun transcriptome uit dit zeldzame celtype onder sterk verschillende omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Methoden voor celdissociatie van Drosophila weefsel zoals imaginale schijven zijn al beschreven23. Onze pogingen om deze procedures op de accessoireklieren gewoon te gebruiken, hebben gefaald en moedigen ons aan om dit nieuwe protocol te ontwikkelen. Protease spijsvertering en mechanische trituratie waren kritische stappen die we lastig voor het succes van de procedure, en we dus geplaatst veel aantekeningen in de paragrafen 2 tot en met 5 om te helpen onderzoekers om bevredigende resulta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de leden van het Karch Lab, de iGE3 Genomics plateform, dankbaar voor de flow Cytometry kern faciliteit van de Universiteit van Genève, en voor Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye die het protocol voor FACS heeft ingesteld. We bedanken Luca Stickley voor zijn hulp bij het visualiseren van de leesbewerkingen op IGV. We danken onszelf voor de voorzichtige toestemming om cijfers te hergebruiken, en de redacteuren om ons te vragen creatief te zijn met schrijven.
Dit onderzoek werd gefinancierd door de staat Genève (CI, RKM, FK), het Zwitsers nationaal fonds voor onderzoek (www.snf.ch) (FK en RKM) en donaties van de Claraz Foundation (FK).
Materials
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μl graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μl bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
