Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Trennung und Sortierung einer bestimmten Zellpopulation von den Drosophila männlichen Zubehördrüsen (Sekundärzellen) für RNA-Sequenzierung und RT-qPCR vor. Die Zellisolation erfolgt durch FACS-Reinigung von GFP-exezierenden Sekundärzellen nach einem mehrstufigen Dissoziationsprozess, der Dissektion, Proteasenverdauung und mechanische Dispersion erfordert.

Abstract

Um die Funktion eines Organs zu verstehen, ist es oft nützlich, die Rolle seiner konstituierenden Zellpopulationen zu verstehen. Leider macht es die Seltenheit einzelner Zellpopulationen oft schwierig, genügend Material für molekulare Studien zu erhalten. Zum Beispiel enthält die Zubehördrüse des männlichen Fortpflanzungssystems Drosophila zwei verschiedene sekretore Zelltypen. Die Hauptzellen machen 96% der Sekretoniezellen der Drüse aus, während die Sekundärzellen (SC) die restlichen 4% der Zellen ausmachen (etwa 80 Zellen pro Männchen). Obwohl beide Zelltypen wichtige Bestandteile der Samenflüssigkeit produzieren, sind nur wenige Gene bekannt, die spezifisch für die SCs sind. Die Seltenheit von SCs hat bisher die transkriptomische Analyse dieses wichtigen Zelltyps behindert. Hier wird eine Methode vorgestellt, die die Reinigung von SCs zur RNA-Extraktion und -Sequenzierung ermöglicht. Das Protokoll besteht darin, zunächst Drüsen von Fliegen zu sezieren, die einen SC-spezifischen GFP-Reporter exezieren, und diese Drüsen dann der Proteaseverdauung und mechanischen Dissoziation zu unterziehen, um einzelne Zellen zu erhalten. Nach diesen Schritten werden einzelne, lebende, GFP-markierte Zellen mit einem fluoreszierenden aktivierten Zellsortierer (FACS) zur RNA-Reinigung sortiert. Dieses Verfahren ergibt SC-spezifische RNAs von 40 Mal pro Zustand für nachgeschaltete RT-qPCR und/oder RNA-Sequenzierung im Laufe eines Tages. Die Schnelligkeit und Einfachheit des Verfahrens ermöglicht es, die Transkriptome vieler verschiedener Fliegen, aus verschiedenen Genotypen oder Umgebungsbedingungen, in kurzer Zeit zu bestimmen.

Introduction

Organe bestehen aus mehreren Zelltypen, die jeweils diskrete Funktionen haben und manchmal sehr unterschiedliche Gensätze ausdrücken. Um ein genaues Verständnis der Funktionsweise eines Organs zu erhalten, ist es oft wichtig, jeden einzelnen Zelltyp zu untersuchen, aus dem dieses Organ besteht. Eine der primären Methoden, die verwendet wird, um mögliche Funktionen zu untersuchen, ist die Transkriptomanalyse. Diese leistungsstarke Methode liefert eine Momentaufnahme der Genexpression in einer Zelle, um aktive Prozesse und Pfade aufzudecken. Diese Art der Analyse ist jedoch oft schwierig für seltene Zellpopulationen, die von weit reichlich erwachsener benachbarten Zellen gereinigt werden müssen. Zum Beispiel ist die Drosophila männliche Zubehördrüse ein Organ, das hauptsächlich aus zwei sekretochen Zelltypen besteht. Da der seltenere der beiden Zelltypen nur 4 % der Zellen dieser Drüse umfasst, wurde die Verwendung einer zelltypspezifischen Transkriptomanalyse nicht verwendet, um die Funktion dieser Zellen zu bestimmen.

Zubehördrüsen (AGs) sind Organe des männlichen Fortpflanzungstraktes bei Insekten. Sie sind verantwortlich für die Produktion der meisten Proteine der Samenflüssigkeit (Seminal fluid proteins (SFPs) und Accessory Drüsenproteine (ACPs)). Einige dieser SFPs sind dafür bekannt, die physiologischen und Verhaltensreaktionen bei gepaarten Weibchen zu induzieren, die gemeinhin als Post-Mating-Antwort (PMR) bezeichnet werden. Einige der PMRs sind: eine erhöhte Eisprung- und Eiablagerate, die Lagerung und Freisetzung von Spermien, eine Änderung der weiblichen Ernährung und eine Abnahme der weiblichen Empfänglichkeit gegenüber sekundären höflichen Männern^1,2. Da Insekten viele wichtige gesellschaftliche Probleme beeinflussen, von der menschlichen Gesundheit (als Vektoren für tödliche Krankheiten) bis hin zur Landwirtschaft (Insekten können Schädlinge sein, aber für bestäubungsmittel und bodenqualität entscheidend sind), ist das Verständnis der Insektenvermehrung ein wichtiger Forschungsbereich. Die Untersuchung von AGs und ACPs wurde mit dem Modellorganismus Drosophila melanogaster signifikant weiterentwickelt. Diese Studien haben die Rolle von AGs und einigen der einzelnen Proteine, die sie bei der Schaffung der PMR produzieren, hervorgehoben, was die Arbeit bei anderen Arten wie dem Krankheitsvektor Aedes aegypti^3,4und anderen Insekten beeinflusst^{1 ,5}. Darüber hinaus werden aGs, wie AGs die Bestandteile der Samenflüssigkeit^1,6 absondern, oft als funktionelles Analogon der Säugetierprostata und der Samenbläschen betrachtet. Diese Funktionsähnlichkeit kombiniert mit molekularen Ähnlichkeiten zwischen den beiden Gewebetypen haben die AGs zu einem Modell für die Prostata in Fliegen⁷gemacht.

Innerhalb der Drosophila Männchen, gibt es zwei Lappen von Zubehör Drüsen. Jeder Lappen kann als eine sackartige Struktur gesehen werden, die aus einer Monoschicht von Sekretorienzellen besteht, die ein zentrales Lumen umgeben, und von glatten Muskeln umwickelt wird. Wie oben erwähnt, gibt es zwei morphologisch, entwicklungs- und funktionell unterschiedliche sekretorische Zelltypen, aus denen diese Drüse besteht: die polygonalen Hauptzellen (die 96 % der Zellen ausmachen) und die größeren, runden Sekundärzellen (SC) (die die verbleibenden 4% der Zellen oder etwa 40 Zellen pro Lappen). Es wurde gezeigt, dass beide Zelltypen unterschiedliche Sätze von ACPs produzieren, um die PMR zu induzieren und aufrechtzuerhalten. Die meisten der bisher gewonnenen Daten unterstreichen die Rolle eines einzelnen Proteins bei der Auslösung der meisten charakteristischen Verhaltensweisen der PMR. Dieses Protein, das Sexpeptid, ist ein kleines, 36 Aminosäurepeptid, das von den Hauptzellen^8,9,10abgesondert wird. Obwohl das Sexpeptid eine wichtige Rolle in der PMR zu spielen scheint, haben andere ACPs, die sowohl von der Haupt- als auch der Sekundärzelle produziert werden, auch verschiedene Aspekte der PMR^{11,12,13,14 beeinflusst ,15,16,17}. Zum Beispiel scheinen die SCs, basierend auf unserem aktuellen Wissen, über die Proteine, die sie produzieren, für die Fortdauer der SP-Signalisierung nach dem ersten Tag¹⁸erforderlich zu sein.

Angesichts der Seltenheit der SCs (nur 80 Zellen pro Männchen) stammt unser gesamtes Wissen über diese Zellen und die Proteine, die sie produzieren, aus Genetik und Kandidatenansätzen. Bisher hat sich gezeigt, dass nur eine relativ kleine Liste von Genen SC-spezifisch ist. Diese Liste enthält das Homeodomain-Protein Defective proventriculus (Dve)¹⁹, die lncRNA MSA²⁰, Rab6, 7, 11 und 19²¹, CG1656 und CG17575^{11, 15,21} und der Homeobox-Transkriptionsfaktor Abdominal-B (Abd-B)¹⁸. Zuvor haben wir gezeigt, dass ein mutierter Mangel sowohl für die Expression von Abd-B als auch für die lncRNA MSA in Sekundärzellen(iab-6^cocuD1 Mutant) die Länge der PMR von 10 Tagen auf nur einen Tag¹² verkürzt. ^{, 18 , 20}. Dieser Phänotyp scheint durch die unsachgemäße Lagerung von SP im weiblichen Fortpflanzungstrakt^12,18,20verursacht zu werden. Auf zellulärer Ebene zeigen die Sekundärzellen dieser Mutante eine abnormale Morphologie und verlieren ihre charakteristischen vacuolähnlichen Strukturen^18,20,21. Mit dieser mutierten Linie haben wir zuvor versucht, Gene zu identifizieren, die an der SC-Funktion beteiligt sind, indem wir die Transkriptionsprofile ganzer AGs entweder von Wildtyp- oder mutierten Zubehördrüsen¹²verglichen haben. Auch andere Labore zeigten, dass SC-Zahl, Morphologie und Vakuolargehalt von der männlichen Ernährung, dem Paarungsstatus und dem Alter^{von 21,25,26}Abs. 1 abhängen.

Obwohl mit diesen Ansätzen positive Fortschritte erzielt wurden, war ein vollständiges SC-Transkriptom bei weitem nicht erreicht. Die Seltenheit dieser Zellen in diesem Organ machte es schwierig, auch von wilden Typzellen weiterzukommen. Für die Erprobung der Genexpression wären Veränderungen in diesen Zellen nach bestimmten Umweltreizen noch schwieriger. Daher war eine Methode zur Isolierung und Reinigung von SC-RNA erforderlich, die schnell und einfach genug war, um unter verschiedenen genetischen Hintergründen und Umweltbedingungen durchzuführen.

Sowohl die Abd-B- als auch die MSA-Gene benötigen einen spezifischen 1,1 kb Enhancer aus dem Drosophila Bithorax Complex (genannt D1 Enhancer) für ihre Expression in SCs^18,20. Dieser Enhancer wurde zuvor verwendet, um einen GAL4-Treiber zu erstellen, der, wenn er mit einem UAS-GFPverknüpft ist, in der Lage ist, eine starke GFP-Expression speziell in SCs zu erzeugen. Daher haben wir diese Zeile als Grundlage für ein FACS-Protokoll verwendet, um diese Zellen sowohl von Wildtyp als auch von iab-6^cocuD1 AGs zu isolieren). Da iab-6^cocuD1 mutierte SCs eine andere zelluläre Morphologie aufweisen, zeigen wir, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um Zellen zur Bestimmung ihres Transkriptoms von diesem seltenen Zelltyp unter sehr unterschiedlichen Bedingungen zu isolieren.

Protocol

1. Drosophila Linien verwendet und Sammlung von Männern Verwenden Sie für dieses Protokoll Männchen, die GFP in den SCs und nicht in den Hauptzellen exemiten. Hierbei wird ein AbdB-GAL4-Treiber (beschrieben in Referenz18), rekombiniert mit UAS-GFP (auf Chromosom 2) verwendet. Andere geeignete Treiber können ebenfalls verwendet werden. Zur Isolierung von SCs unter verschiedenen mutierten Bedingungen, kreuzen Sie die Mutation in Linien, die die SC-spezifische…

Representative Results

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht es einem Experimentator, Sekundärzellen aus Drosophila männlichen Zubehördrüsen zu isolieren und ihre RNA im Laufe eines tages zu extrahieren (Abbildung 1). Wir verwenden das Abd-B-GAL4-Konstrukt 18, um sekundäre Zellen (SC) zu kennzeichnen, aber nicht Hauptzellen (MC) mit GFP (Abbildung 2…

Discussion

Methoden zur Zelldissoziation aus Drosophila-Gewebe wie imaginäre Scheiben sind bereits beschrieben²³. Unsere Versuche, diese Verfahren einfach auf Zubehördrüsen anzuwenden, sind gescheitert und haben uns ermutigt, dieses neue Protokoll zu entwickeln. Protease-Verdauung und mechanische Trituration waren kritische Schritte, die wir für den Erfolg des Verfahrens in Schwierigkeiten gebracht haben, und so haben wir viele Hinweise in die Abschnitte 2 bis 5 platziert, um Experimentatoren zu…

Materials

24-wells Tissue Culture plate	VWR	734-2325
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Draq7 0.3 mM	BioStatus	DR71000
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
ImProm-II Reverse Transcription System	Promega	A3800
MasterPure RNA Purification Kit	Epicentre	MCR85102
Nextera XT kit	illumina		https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
PolydT primers
Random hexamer primers
RNA 6000 Pico kit	Agilent
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
SMARTer cDNA synthesis kit	Takara		https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFX	applied biosystems	4472942
Thermo Shaker	Hangzhou Allsheng intruments	MS-100
Tipone 1250 μl graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μl bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013
Vortex