En FACS-basert protokoll for å isolere RNA fra sekundære celler av Drosophila mannlig tilbehør kjertler

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å distansere og sortere en bestemt cellepopulasjon fra Drosophila mannlige tilbehør kjertler (sekundær celler) for RNA SEKVENSERING og RT-qPCR. Celle isolasjon oppnås gjennom FACS rensing av GFP-uttrykker sekundære celler etter en flertrinns-dissosiasjon prosess som krever disseksjon, proteaser fordøyelsen og mekanisk dispersjon.

Abstract

For å forstå funksjonen av et organ, er det ofte nyttig å forstå rollen til sine bestanddeler celle populasjoner. Dessverre gjør sjeldenhet av individuelle celle populasjoner ofte det vanskelig å få nok materiale for molekylær studier. For eksempel inneholder tilbehør kjertel av Drosophila mannlige reproduktive system to forskjellige sekretoriske celletyper. De viktigste cellene utgjør 96% av de sekretoriske cellene i kjertelen, mens de sekundære cellene (SC) utgjør de resterende 4% av cellene (ca 80 celler per hann). Selv om begge celletyper produserer viktige komponenter i sædvæsken, er det bare noen få gener som er kjent for å være spesifikke for SCs. Sjeldenhet av SCs har hittil hindret transcriptomic analyse studie av denne viktige celletypen. Her presenteres en metode som gjør det mulig å rense SCs for RNA-ekstraksjon og-sekvenser. Protokollen består i første dissekere kjertler fra fluer uttrykker en SC-spesifikk GFP reporter og deretter utsette disse kjertlene til protease fordøyelsen og mekaniske dissosiasjon å få individuelle celler. Etter disse trinnene, individuelle, levende, GFP-merkede celler sorteres ved hjelp av en fluorescerende aktivert celle Sorter (FACS) for RNA rensing. Denne prosedyren gir SC-spesifikke RNAs fra ~ 40 menn per betingelse for nedstrøms RT-qPCR og/eller RNA-sekvensering i løpet av en dag. Den hurtighet og enkelhet av prosedyren gjør det mulig for transcriptomes av mange forskjellige fluer, fra ulike genotyper eller miljømessige forhold, som skal fastsettes i løpet av kort tid.

Introduction

Organer består av flere celletyper, hver med diskrete funksjoner og noen ganger uttrykker svært forskjellige sett av gener. For å få en presis forståelse av hvordan et organ fungerer, er det ofte kritisk å studere hver distinkt celle type som utgjør dette organet. En av de viktigste metodene som brukes til å utforske mulige funksjonen er transcriptome analyse. Denne kraftige metoden gir et øyeblikksbilde av genuttrykket i en celle, for å avdekke aktive prosesser og trasé. Men denne typen analyser er ofte vanskelig for sjeldne celle populasjoner som må renses fra langt mer-rikelig nabokommunene celler. For eksempel er Drosophila mannlige tilbehør kjertel et organ bestående hovedsakelig av to sekretoriske celletyper. Som sjeldnere av de to celletyper består bare 4% av cellene i denne kjertel, bruk av en celle-type spesifikk transcriptome analyse ikke hadde blitt brukt til å bestemme funksjonen til disse cellene.

Tilbehør kjertler (AGs) er organer av den mannlige reproduktive tarmkanalen i insekter. De er ansvarlig for produksjon av de fleste proteiner av sædvæsken (SFP) og tilbehør kjertel proteiner (ACPs)). Noen av disse SFP er kjent for å indusere fysiologiske og atferdsmessige responser i paret kvinner, ofte kalt post-paring respons (PMR). Noen av PMR inkluderer: en økt eggløsning og egg-legging rente, lagring og frigjøring av sperm, en endring i kvinnelig diett, og en nedgang i kvinnelige mottakelighet til sekundære frieri menn^1,2. Som insekter påvirker mange store samfunnsmessige spørsmål fra menneskers helse (som vektorer for dødelige sykdommer) til landbruk (insekter kan være skadevirkninger, men er avgjørende for pollinering og jord kvalitet), forståelse insekt reproduksjon er et viktig område for forskning. Studiet av AGs og ACPs har vært avansert betydelig med modellen organismen Drosophila melanogaster. Disse studiene har fremhevet rollen som AGS og noen av de enkelte proteiner som de produserer i å skape PMR, påvirker arbeidet i andre arter som sykdommen vektor Aedes aegypti^3,4og andre insekter^{1 ,5}. Videre, som AGS skiller bestanddelene av sædvæsken^1,6 de er ofte tenkt på som funksjonell analog av pattedyr prostatakjertel og sæd vesicle. Denne funksjonen likheten kombinert med molekylære likheter mellom de to vev-typer, har gjort AGs en modell for prostatakjertel i fluer⁷.

Innenfor Drosophila hann, er det to fliker av tilbehør kjertler. Hver flik kan ses som en SAC-lignende struktur består av en monolag av sekretoriske celler rundt en sentral lumen, og innpakket av glatte muskler. Som nevnt ovenfor, er det to morfologisk, developmentally og funksjonelt distinkte sekretoriske celletyper som utgjør denne kjertel: de mangekantet-formede hoved cellene (utgjør ~ 96% av cellene), og de større, runde sekundære celler (SC) (gjør opp resterende 4% av celler, eller ca 40 celler per flik). Det har blitt vist at begge celletyper produsere distinkte sett med ACPs å indusere og vedlikeholde PMR. De fleste av dataene innhentet hittil markere rollen som et enkelt protein i utløser det meste av karakteristisk oppførsel av PMR. Dette proteinet, Sex peptid, er en liten, 36 amino acid peptid som skilles ut av de viktigste cellene^8,9,10. Selv om sex peptid synes å spille en viktig rolle i PMR, andre ACPs, produsert av både de viktigste og sekundære celler, har også vist å påvirke ulike aspekter av PMR^{11,12,13,14 ,15,16,17}. For eksempel, basert på vår nåværende kunnskap, SCs, via proteiner de produserer, synes å være nødvendig for opprettholdelse av SP signalering etter den første dagen¹⁸.

Gitt sjeldenhet av SCs (bare 80 celler per hann), all vår kunnskap om disse cellene og proteiner de produserer kommer fra genetikk og kandidat tilnærminger. Hittil har bare en relativt liten liste over gener blitt vist å være SC-spesifikk. Denne listen inneholder homeodomain protein defekt proventriculus (DVE)¹⁹, lncRNA MSA²⁰, Rab6, 7, 11 og 19²¹, CG1656 og CG17575^{11, 15,21} og homeobox transkripsjon faktor abdominal-b (Abd-b)¹⁸. Tidligere har vi vist at en mutant mangelfull for både uttrykk for Abd-B og lncRNA MSA i sekundære celler (IAB-6^COCUD1 mutant) forkorter lengden på PMR fra ~ 10 dager til bare en dag^{12 , 18 av år , 20}. dette fenotype synes å være forårsaket av feil lagring av SP i den kvinnelige reproduktive luftveiene^12,18,20. På cellenivå, de sekundære cellene i denne mutant viser unormal morfologi, miste sine karakteristiske vacuole-lignende strukturer^18,20,21. Ved å bruke denne mutant linjen, har vi tidligere forsøkt å identifisere gener involvert i SC funksjon ved å sammenligne transcriptional profilene til hele AGs fra enten vill type eller mutant tilbehør kjertler¹². Også viste andre Labs at SC nummer, morfologi og vacuolar innhold avhengig av mannlig diett, mating status og alder^21,25,26.

Selv om positiv fremgang ble gjort ved hjelp av disse tilnærmingene, en full SC transcriptome var langt fra oppnådd. Sjeldenhet av disse cellene i dette organet gjorde det vanskelig å utvikle seg videre selv fra ville type celler. For testing genuttrykk, endringer i disse cellene etter bestemte miljømessige stimuli ville bli enda vanskeligere. Således var det nødvendig med en metode for å isolere og rense SC RNA som var rask og enkel nok til å utføre under ulike genetiske bakgrunner og miljøforhold.

Både Abd-B og MSA gener krever en bestemt 1,1 kb Enhancer fra Drosophila Bithorax kompleks (kalt D1 Enhancer) for deres uttrykk i SCs^18,20. Denne Enhancer har tidligere blitt brukt til å lage en GAL4 driver som, når den er assosiert med en UAS-GFP, er i stand til å drive sterke GFP uttrykk spesielt i SCs. Derfor brukte vi denne linjen som grunnlag for en FACS-protokoll for å isolere disse cellene fra både vill type og IAB-6^cocuD1 AGS). Som IAB-6^CocuD1 mutant SCs display en annen cellulær morfologi, viser vi at denne protokollen kan brukes til å isolere celler for fastsettelse av deres transcriptome fra denne sjeldne celletypen under svært forskjellige forhold.

Protocol

1. Drosophila linjer brukt og samling av hanner For denne protokollen, bruk menn uttrykker GFP i SCs og ikke de viktigste cellene. Her brukes en AbdB-GAL4- driver (beskrevet i referanse18), SAMAN med UAS-GFP (på Kromosom 2). Andre egnede drivere kan også brukes. For isolering av SCs under ulike muterte forhold, krysser du mutasjonen i linjer som inneholder SC-spesifikke GFP-linjen. Samle to grupper på rundt 25 friske, jomfru hanner for hver genotyp…

Representative Results

Protokollen som presenteres her gjør det mulig for en eksperimentator å isolere sekundære celler fra Drosophila mannlige tilbehør kjertler og å trekke ut sin RNA i løpet av en enkelt dag (figur 1). Vi bruker Abd-B-GAL4 konstruere18 til Label sekundære celler (SC), men ikke hoved celler (MC) med GFP (figur 2A</stro…

Discussion

Metoder for celle dissosiasjon fra Drosophila vev som imaginal plater er allerede beskrevet²³. Våre forsøk på å bare bruke disse prosedyrene på tilbehør kjertler mislyktes, oppmuntre oss til å utvikle denne nye protokollen. Protease fordøyelsen og mekaniske trituration var kritiske skritt vi feilsøkt for suksessen til prosedyren, og vi plasserte dermed mange notater i seksjonene 2 til 5 for å hjelpe forskere med å oppnå tilfredsstillende resultater. For dissosiasjon å være v…

Materials

24-wells Tissue Culture plate	VWR	734-2325
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Draq7 0.3 mM	BioStatus	DR71000
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
ImProm-II Reverse Transcription System	Promega	A3800
MasterPure RNA Purification Kit	Epicentre	MCR85102
Nextera XT kit	illumina		https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
PolydT primers
Random hexamer primers
RNA 6000 Pico kit	Agilent
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
SMARTer cDNA synthesis kit	Takara		https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFX	applied biosystems	4472942
Thermo Shaker	Hangzhou Allsheng intruments	MS-100
Tipone 1250 μl graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μl bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013
Vortex