Summary

بروتوكول تجميد السحق لمعالجه الكفوف الماوس لتقييم المسارات الجزيئية للالتهابات الانسجه في الكولاجين المستحثة نموذج التهاب المفاصل

Published: October 30, 2019
doi:

Summary

تم تطوير طريقه السحق المبردة لمعالجه الكفوف murine باستخدام مطحنه النيتروجين السائل التجميد لتحسين الغلة وجوده الحمض الريبي النيبالي أو البروتين المستخرج من الانسجه وتمكين تحليل الملامح الجزيئية المرتبطة التهابات الاستجابات.

Abstract

تنميط التغيرات الجزيئية في الانسجه المحلية أمر حاسم لفهم اليه (ق) عمل المرشحين العلاجية في الجسم الحي. في مجال البحوث التهاب المفاصل ، وتركز العديد من الدراسات علي المفاصل الملتهبة التي تتكون من خليط معقد من العظام والغضاريف والعضلات والخلايا اللحمية والخلايا المناعية. هنا ، انشانا طريقه ميكانيكيه موثوقه وقويه لتعطيل الكفوف الماوس ملتهبة في عينات المسحوق متجانسة في بيئة تسيطر عليها الديتريوم. وتمت معالجه البروتينات والحمض الريبي النيبالي لتمكين نقاط النهاية البروتينية والمتحولة والتوصيف الجزيئي لمسارات الامراض ذات الصلة في الانسجه المحلية.

Introduction

التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مزمن الجهازية مع التهاب الغدة الدرقية المتماثل المستمر في المفاصل ومشاركه مفصليه اضافيه من أجهزه مثل الجلد والقلب والرئتين ، والعينين1. علي الرغم من ان المظاهر الجهازية للاستجابة المناعية واضحة في المرضي البشريين ، واحده من السمات المميزة للامراض RA هو تسلل الخلايا المناعية في الانسجه الزليلي وانتشار الخلايا الليفية الزليلي2.

علي غرار RA الإنسان ، الكولاجين الماوس المستحثة التهاب المفاصل (CIA) نموذج يثير التهاب الانسجه القوية مع الاستجابات المناعية النشطة في الانسجه الزليلي والمقصورات الجهازية. الحساسية من سلالات الماوس مختلفه لارتباطات نموذج وكاله المخابرات الخاصة إلى مجمع التوافق الرئيسية (mhc) النمط والخلية المحددة antigen T و B التفاعلات الخلية3,4. الاضافه إلى ذلك ، فان العديد من المسارات المسببة للامراض في RA الإنسان ، بما في ذلك إنتاج الأجسام المضادة ، وترسب معقده المناعي ، وتنشيط الخلايا النخاعية ، ومظاهر متعددة المفصليات وتشكيل بانيوس مع تسلل المناعي الزليلي ، هي أيضا واضحة في هذا النموذج 5,6. وقد استخدم المحققون هذا النموذج الراسخ CIA للتحقيق في اثار العلاجات السايسيسين المضادة للالتهابات7. وقد تم العثور علي العديد من البيولوجية المعتمدة للامراض المناعية الذاتية أو التهابيه ، مثل المضادة لل tnfα والمضادة لل-6 ، ان تكون فعاله في نموذج8،9وكاله المخابرات العامة.

التنميط التفاعلات من الجهاز المناعي في الانسجه الزليلي أمر حاسم لتوضيح أليات الجزيئية المرتبطة بالتسبب في RA. في البيئة السريرية البشرية ، والممارسة الشائعة هي اجراء الخزعات الزليلي الابره تحت اشراف التصوير بالموجات فوق الصوتية. في الإعدادات الاكلينيكيه ، يجعل الهيكل الأصغر للمفاصل الmurine إجراءات الخزعة أكثر صعوبة ان لم يكن مستحيلا. في الاونه الاخيره ، أظهرنا استخدام نموذج murine CIA لتقييم مجموعات من الادويه للتاثير علي نقاط النهاية المتباينة وحل المرض في نهج التوافقية10. وقد استخدمت طريقه الطحن المبردة طاحونة القائم علي مطحنه لمعالجه الكفوف murine الملتهبة في مساحيق ناعمه متجانسة والعمليات التي أنشئت المصب لاستخراج الحمض الريبي النيبالي والبروتينات. هذه الطريقة تحمي الحمض الريبي النيبالي والبروتين من العمليات الانزيميه والكيميائية degrative وتمكننا من تطبيق أساليب تحليليه متعددة لمصدر عينه متجانس واحد.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا لسياسات اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها التابعة لشركه Janssen R & D. 1. المبردة تجميد مطحنه القائم علي طريقه الطحن عند إنهاء دراسة وكاله المخابرات الخاصة ، والفئران التضحية مع 1.5 ٪ ايزوفلوراني تليها خلع عنق الرحم. في ي?…

Representative Results

هنا ، ونحن نظهر ممثل التصور الصورة هلام من الجيش النيبالي الريبي المستخرجة من الكفوف الاماميه من الفئران CIA في الشكل 2ا. RRNA 28S و rRNA 18S الفرقة تشير إلى جميع العينات لديها كميه كافيه من الحمض الريبي النيبالي سليمه. المقبل ، ونحن تظهر مؤامرة مبعثر ممثل…

Discussion

علي الرغم من ان هناك مبرر علمي قوي لتقييم المسارات الجزيئية في الانسجه الزليلي ، وركزت العديد من التقارير علي التنميط المناعي للنموذج murine CIA علي الدم المحيطي ، في حين ان البروتين وبيانات تحليل RNA من الكفوف الملتهبة محدوده نوعا ما. هناك العديد من الأسباب المحتملة لهذا التحيز: المفاصل الكاحل…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويود المؤلفون ان يشكروا اديث جانسين علي المراجعة النقدية لمخطوطه نافين راو وجنيفر تاون لدعمهما لنشر هذه المخطوطة.

Materials

5 mm stainless steel bead Qiagen 69989
beta-mercaptoethanol Sigma M6250 Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit Agilent 5067-1511 RNA qualification kit
b-mercaptoethanol Sigma M6250
Cell Culture Grade Water Corning 25-055-CI Water
Cell lysis stock solution Cell Signaling 9803
Eppendorf Tube Eppendorf 22363204 Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box Nalgene 5055 Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker Benchmark Scientific BR5000
Freezer Mill Spex Sample Prep 6875 Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial Spex Sample Prep 6801 Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit Pierce 23225 Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1 Calbiochem 539131 Protease Inhibitors
Protein BCA Kit Pierce 23225
Quantigene Kit Thermofisher QP1013 bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf 5417R Centrifugation
RLT Buffer Qiagen 79216 RNA extraction buffer
RNeasy mini kit Qiagen 74104 including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker Benchmark Scientific BR5000 Rocker/Shaker
Spatula VWR 10806-412 Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead Qiagen 69989 Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor Spex Sample Prep 6884 Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer VWR 10153-838 Sample mixing

References

  1. Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
  2. McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
  3. Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
  4. David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
  5. Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
  6. Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
  7. Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
  8. Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
  9. Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
  10. Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).

Play Video

Cite This Article
Jones, B., Hitchcock, S., Loza, M., Malaviya, R., Ort, T., Shen, F. A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model. J. Vis. Exp. (152), e60229, doi:10.3791/60229 (2019).

View Video