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Developmental Biology

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

Published: November 09, 2019
doi:
10.3791/60234
, , , ,
1Nationwide Children’s Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

Summary

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

Abstract

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC)는 혈액 형성의 요구를 유지하기 위해 그들의 정지 상태에서 분화 상태로 전환 할 수 있습니다 뚜렷한 대사 가소성을 가지고있다. 그러나 HSPC의 대사 상태(미토콘드리아 호흡 및 당해 용해)는 제한된 수와 비부착성, 깨지기 쉬운 HSPC에 대한 최적화된 프로토콜의 부족으로 인해 분석하기가 어려웠습니다. 여기에서, 우리는 신진 대사 호흡을 측정하기 위하여 명확한, 단계별 지침의 세트를 제공합니다 (산소 소비 비율; OCR) 및 당해(세포외 산성화 속도; Murine 골수-리니지negSca1+c-Kit+ (LSK) HSPC의 ECAR) 이 프로토콜은 뮤린 골수에서 LSK HSPC의 높은 양을 제공하고, 배양 중 HSPC의 생존력을 향상시키고, 비 부착 HSPC의 세포 외 플럭스 분석을 용이하게 하며, 산화 인산화 및 당해 경로를 표적으로 하는 약물에 최적화된 주사 프로토콜(농도 및 시간)을 제공합니다. 이 방법은 혈액 발달 및 질병 도중 HSPC의 신진 대사 상태 그리고 건강의 예측가능하게 합니다.

Introduction

대부분의 성숙한 혈액 세포의 수명이 짧기 때문에, 혈액의 항상성은 조혈 줄기 세포 (HSPC)의 장수하지만 희귀 한 집단의 자기 갱신 및 분화에 의존합니다1. HSPC는 정지, 하지만 그들은 증식 하 고 혈액 시스템의 요구를 유지 하기 위해 자극에 차별화를 겪고 신속. 각 HSPC 세포 상태는 독특한 생체 에너지 수요를 필요로하기 때문에, 신진 대사 변화는 HSPC 운명 결정의 주요 드라이버입니다. 따라서, 대사 가소성의 손실은, 정지, 자기 갱신 및 HSPC의 분화 사이의 평형을 변경함으로써, 종종 골수- 또는 림프증증성 장애로 이어집니다. 함께, HSPC 개발의 대사 조절의 이해는 혈액 학적 악성2,3,4,5의 근본적인 메커니즘을 발견하는 데 중요합니다.

미토콘드리아 호흡과 당해는 ATP를 생성하여 세포내 반응을 유도하고 거대분자 합성에 필요한 빌딩 블록을 생성합니다. HSPC는 분화 된 세포에 비해 낮은 미토콘드리아질량을 가지고 있기 때문에 6 그들은 저산소 골수 틈새 에 정지를 유지, HSPC는 주로 당해에 의존. HSPC의 활성화는 정지의 손실과 세포 주기로의 후속 항목으로 이어지는 미토콘드리아 대사를 향상시킵니다. HSPC의 이러한 대사 가소성은 성인 생활6,7,8,9,10,11,12에 걸쳐 HSPC 풀의 유지 보수를 허용합니다. 따라서, HSPC 활성화 및 건강 상태를 분석하기 위해 산소 소비율(OCR; 산화 인산화 지수) 및 세포외 산성화 율(ECAR; glycolysis 의 지수)과 같은 그들의 대사 활동을 조사하는 것이 중요하다. OCR과 ECAR는 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 실시간으로 동시에 측정할 수 있습니다. 그러나, 현재의 방법은 많은 수의 셀을 필요로 하며 부착셀(13)에최적화되어 있다. HSPC는마우스(14)로부터대량으로 분리될 수 없기 때문에, 순수한 집단을 얻기 위해 선별이 필요하고, 비부착세포(15)이며,분화를피하지 않고 하룻밤 배양될 수 없고, HSP의 OCR 및 ECAR를 측정하는 것이 어려웠다. 여기에서는 수천 개의 뮤린 골수-리니지negSca1+c-Kit+ (LSK) HSPC의 대사 호흡 및 당해 를 측정하는 방법에 대한 비디오 기반 자습서를 동반하는 명확한 단계별 지침 세트를 제공합니다.

Protocol

이 프로토콜은 전국 어린이 병원 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 참고: 프로토콜은 2 일의 기간에 걸쳐 연대순으로 설명된다. 아래 프로토콜에 설명된 대로 신선한 시약을 사용하십시오. 1. 분석 전날 시약 준비 센서 카트리지에 수분을 공급합니다. 비CO2 37°C 인큐베이터에서 교정제…

Representative Results

우리의 추출 방법은 우리가 마우스 당 ~ 80,000 LSK HSPC까지 수확 할 수 있었습니다. LSK 세포의 생존력과 수는 우리의 방법으로 향상되었다, 우리는 때문에: (1) 상지와 하부 사지에서 결합 된 골수, 엉덩이 뼈, 흉골, 늑골 케이지, 및 척추, (2) 세포 사멸과 응집 증가 했을 붉은 세포 용해 버퍼를 사용하여 피, (3) 단핵세포의 밀도 구배 배지 분리를 사용하고, (4) 덩어리에서 세포의 손실을 야기했을 사전 ?…

Discussion

여기에서, 우리는 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 순수하고 실행 가능한 뮤린 LSK HSPC 집단의 최대 양뿐만 아니라 그들의 당해 및 미토콘드리아 호흡의 측정의 격리를 보여줍니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 LSK HSPC의 사용에 대한 다음과 같은 기술적 문제를 극복한다 : i) murine 골수14에서LSK HSPC의 낮은 빈도, ii) LSK HSPC26의낮은 기저 대사 활성, iii) LSK HSPC<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 부분적으로 국립 보건원 (HL131645, CA016058), 세인트 볼드릭 재단 및 펠로토니아 재단의 자금 지원에 의해 지원됩니다.

Materials

0.01% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920 Used for LSK attachment
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22-363-547 Used for cell filtration after bone crushing
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi 130-090-485 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 BD Biosciences 553086 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 BD Biosciences 553019 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 BD Biosciences 553029 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 BD Biosciences 553125 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 BD Biosciences 553672 Used for Lin- separation
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC eBioscience 17-1171-83 Used for LSK sorting
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-11A Used for LSK sorting
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001-HI Used in FACS buffer
Histopaque-1083 Sigma 10831 Used for ficoll gradient separation
L-glutamine 100x Fisher Scientific 25-030-081 Used for the assay media
LS Column Miltenyi 130-042-401 Used for Lin- separation
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5981-82 Used for LSK sorting
Murine Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 250-03-100UG Used for the assay media
Murine Thrombopoietin (TPO) PeproTech 315-14-100UG Used for the assay media
PBS 1% Fisher Scientific SH3002802 Used for FACS buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15140122 Used for the assay media
Propidium Iodide Fisher Scientific P1304MP Used for LSK sorting
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100 Used for LSK seeding
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher 11360070 Used for the assay media
Streptavidin eFluor 450 Conjugate eBioscience 48-4317-82 Used for LSK sorting
XF Calibrant Agilent Technologies 100840-000 Used for cartridge equilibration
XF media Agilent Technologies 103575-100 Used for the assay media
XFp Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103017100 Drugs for glycolysis stress test
XFp Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103010100 Drugs for mitochondrial stress test
XFp Sensor Cartridge Agilent Technologies 103022-100 Used for glycolysis and mitochondrial stress test
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References

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Scapin, G., Goulard, M. C., Dharampuriya, P. R., Cillis, J. L., Shah, D. I. Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (153), e60234, doi:10.3791/60234 (2019).
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