Her beskriver vi gennemførelsen og fortolkningen af resultaterne af en in vitro mammosphere selvfornyelse kvantitativ analyse.
Brystkirtlen er karakteriseret ved omfattende regenereringsevne, da det går gennem massive hormonelle ændringer i hele livscyklussen for en kvindelig. Rollen af bryst stamceller (MASCS) er almindeligt undersøgt både i den fysiologiske/udviklingsmæssige sammenhæng og med hensyn til bryst carcinogenese. I dette aspekt, ex vivo undersøgelser fokuseret på MaSC egenskaber er meget eftertragtede. Mammosphere kulturer repræsenterer en surrogat af organdannelse og er blevet et værdifuldt redskab for både grundlæggende og Translationel forskning. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for generering af murine primære mammosphere kulturer og kvantitation af MaSC vækstegenskaber. Protokollen omfatter indsamling og fordøjelse af brystkirtler, isolering af primær bryst epiteliale celler (mecs), etablering af primære mammosphere kulturer, seriel passaging, kvantitation af mammosphere vækstparametre og fortolkning af resultaterne. Som et eksempel præsenterer vi effekten af lav-niveau konstitutiv MYC udtryk på normal MECs fører til øget selvfornyelse og spredning.
Isolation og in vitro-kultur af bryst epitelial stilk og stamceller er blevet afgørende for at forstå deres egenskaber i bryst cellebiologi. Elegant Lineage Tracing og serielle transplantations assays har gjort det muligt at studere stamceller (SCs) og andre vævs undersæt i forbindelse med deres in vivo niche. Men denne fremgangsmåde er tidskrævende og kræver generering af reporter musemodeller1,2,3,4,5. Derfor, in vitro-kultur og formering af bryst stamceller (MASCS), mens besparende nøgle stemthed funktioner, nemlig selvfornyelse og differentiering evne, er en af de største udfordringer i marken. I de seneste år, mammosphere assay har været almindeligt anvendt til at modellere både normal bryst væv og brystkræft vækst, at kvantificere normal eller Cancer SCS (CSCS) og vurdere deres selvfornyelse evne som en surrogat reporter af deres aktivitet i deres respektive in vivo kontekst6,7,8,9,10,11.
Mammosphere assay er en effektiv og omkostningseffektiv tilgang, hvor frisk isolerede bryst epiteliale celler (mecs) dyrkes i ikke-tilhængere betingelser, med den forudsætning, at kun MASCS vil overleve og danne kugler i suspension, mens alle de andre celletyper vil dø af anoikis. Desuden er evnen til at danne flere generationer af mammokugler i serielle ikke-tilhængere passager er relateret til selvfornyelse evne af MASCS6,9,11. Her beskriver vi en detaljeret protokol for en kvantitativ mammosphere-analyse, som oprindeligt blev udviklet af dontu og kolleger7 som en ændring af den banebrydende sfære assay12, der muliggør vækst af formodede SCS i ikke-vedtagtige, serum frie forhold med tilsætning af passende vækstfaktorer7,12.
Her beskriver vi en protokol for den kvantitative beskrivelse af MaSC Growth Properties in vitro. Som et eksempel præsenterer vi effekten af lav-niveau konstitutiv MYC udtryk på normale murine MaSCs. Denne fremgangsmåde kan dog også anvendes i forskellige sammenhænge. Humane eller murine primærceller, samt etablerede cellelinjer, kan dyrkes i forankring uafhængige betingelser for at etablere mammosphere kulturer, der kan være serielt passaged. Genet overekspression og RNA-interferens kan let introduceres i protokollen med tilsætning af et viral transduktionstrin i slutningen af den første passage (efter trin 3,5). Alternativt kan celler være inficeret i adhæsion og derefter belagt som mammokugler.
Et kritisk aspekt af analysen præsenteres her er såning celletæthed, som bør være lav nok til at undgå generering af aggregater blande sig med fortolkningen af resultaterne16,17. Morfologien i mammosfærerne kan være informativ for at løse denne tvetydighed. Kun kompakte, runde kugler skal optælles i slutningen af hver passage. Både cirkularitet af sfæroider og størrelsen bør tages i betragtning. Ved hjælp af den automatiserede proces af DIA, dette trin er sikret med passende tærskler på en objektiv og absolut måde. Ofte vil progenitorer danne acinic strukturer eller mindre klynger af celler, som bør udelukkes fra mammosphere tællinger. Som en tommelfingerregel bruger vi en tærskel på 100 μm diameter. Endelig skal der udvises forsigtighed for at undgå overførsel af intakte eller ikke-fuldt dissocierede mammopsheres fra en passage til den næste. På den anden side, overskydende pipettering vil føre til øget celledød. Hvis sådanne vanskeligheder opstår, anbefaler vi, at du bruger mild trypsinisering eller Accutase-behandling og passerer de dissocierede sfærer gennem en 40 μm-si for at sikre dannelse af enkelt celle suspensioner.
Sfære, der danner effektivitet (SFE), er blevet anvendt alternativt som et surrogat for SC eller CSC-kvantitation ex vivo i mammosphere-kulturer. SFE er faktisk et mål for Stem-lignende celler i en given cellepopulation. Det er imidlertid en mindre samvittighedsfuld tilgang, da den kun giver oplysninger på særskilte tidspunkter. Beregningen af kumulative sfære numre og generering af kumulative vækstkurver, i stedet, gør det muligt at udlede af vækstraten af kulturen fra den indledende celle såning trin, indtil kulturen udstøde eller, i tilfælde af udødeliggjort kulturer, for det ønskede antal passager. Vurderingen af vækstegenskaber gør det muligt at evaluere afvigelsen fra den eksponentielle vækst gennem koefficienten R2 og, på et andet trin, vurderingen af selve gr-værdien.
Vigtigere, kumulative mammosphere vækstkurver kan bruges til at evaluere effekten af små molekyle hæmmere eller andre kemoterapeutiske lægemidler selektivt på CSC niveau6,11. I modsætning til normale primære mammokugler, som funktionelt udstødning i 5-7 passager, tumor mammokugler tendens til at ekspandere på ubestemt tid. Denne funktion er knyttet til ubegrænset CSC selvfornyelse evne. Virkningerne på spredning og CSC selvfornyelse kan være koblet gennem generation af tumor celle og mammosphere vækstkurver, hhv. En CSC-specifik effekt forventes at resultere i et fald i den kumulative mammosphere-vækstrate med eller uden virkning på den kumulative cellevækst rate6,11.
Endelig er et andet område af interesse er den ene af voksne væv SC omprogrammering. Fuldt dyrkede mammokugler består af en fænotypisk heterogene cellepopulation, hvor kun en mindre fraktion bevarer Stem-lignende egenskaber, herunder mammosphere-initiering evne og Brystkirtel Regeneration ved transplantation i vivo6,9,11,18,19. Bryst progenitorer kan således isoleres enten ved hjælp af in vitro-mærke-tilbageholdelse af assays6,9,11 eller ex vivo ved hjælp af etablerede overflade markører2,3. Især bryst forfædre ikke overlever anoikis og er i stand til at danne mammokugler. Tvungen MYC-ekspression har vist sig at give mammosphere Initierings potentiale til bryst-stamceller isoleret som pkhneg11, hvilket resulterer i dannelse af en kultur, der kan urerne på ubestemt tid. Tilsvarende kan interferens fra negative regulatorer af fysiologisk omprogrammering testes ved hjælp af den samme analyse. I denne sammenhæng er et begrænset antal celle input et fælles problem, der kan opstå. Hvis celle input er lavere end 10.000 celler, anbefaler vi såning i 24-brønd plader (maksimum 5.000 levedygtige celler/mL). Ikke desto mindre kan forankringen af uafhængige dyrkningsbetingelser påvises at være for barsk til at score omprogrammering, især i tilfælde, hvor omprogrammerings effekten ikke er umiddelbar. I sådanne tilfælde kan brugen af en støttende matrix og 3-dimensionelle organoid kulturer være mere passende20.
Samlet set mammosphere assay er en omkostningseffektiv løsning, der let kan anvendes til at score Stem-lignende egenskaber i normal og tumor MEC populationer. Den kvantitative tilgang i denne protokol letter sammenligningen mellem kulturer, der gennemføres under forskellige forhold eller udsættes for forskellige stimuli. Når det følges nøje, giver det et relativt simpelt ex vivo model system, der tillader afkobling af de mange spillere, der definerer Stam egenskaber in vivo, giver mulighed for mere detaljerede Mekanistiske undersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Bruno Amati for den slags gave af Rosa26-MycER transgene musemodel. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra WWCR, AIRC, ERC og det italienske sundhedsministerium til P.G.P. T.V. og X.A. blev støttet af FIRC og A.S. af en FUV Grant.
ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor – basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |