新規ビオチニル化酵素の選択のための細菌ペプチド表示
Summary
ここでは、特定の標的ペプチドをビオチン化する大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAの新規変異体を選択する方法を提示する。プロトコルは、標的ペプチドの細菌表示のためのプラスミドの構築、BirAライブラリーの生成、BirA変異体の選択および特徴付けについて説明する。
Abstract
ビオチンは、タンパク質の単離と検出のための強力なタグを提供するタンパク質の魅力的な翻訳後修飾です。大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAによる酵素生物化は非常に特異的であり、そのネイティブ環境における標的タンパク質の生体化を可能にする。しかしながら、BirA媒介バイオチリン化の現在の使用法は、標的タンパク質中の合成アクセプターペプチド(AP)の存在を必要とする。したがって、その用途は、APを含むするように設計されたタンパク質に限定される。本プロトコルの目的は、未修飾標的タンパク質に由来するペプチドの細菌表示を用い、ペプチドを生体化するBirA変異体を選択することである。システムは細菌表面のペプチド表示のための足場と共にBirA変異体の共発現を可能にする単一のプラスミドに基づいている。このプロトコルは、ターゲットペプチドをディスプレイ足場に組み込む場合の詳細な手順、BirAライブラリの作成、アクティブなBirA変異体の選択、および単離されたBirA変異体の初期特性を説明する。この方法は、複雑な溶液中で天然タンパク質を生体化するビオチンタンパク質リチウムのさらなる方向進化に使用できる新規BirA変異体の単離に対して非常に効果的な選択システムを提供する。
Introduction
タンパク質のバイオチリン化は、その親和性の単離および検出のための強力なタグを作成します。酵素タンパク質バイオチニル化は、ビオチンタンパク質リチウムによって触媒された非常に特異的な翻訳後修飾である。大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAは、非常に特異的であり、共有的に特定のリジン残剤1で天然に存在するタンパク質の制限された数のみを共有生物化する。BirA触媒バイオチニル化の利点は、現在、効果的にビオチン化された小さな合成15-アミノ酸ビオチンアクセプテイタペプチド(AP)と標的タンパク質を融合することによって利用され、非常に特異的であり、Via3,4,5の共発現または添加による生体内およびインビトロバイオチニル化の効率的な。インビボおよびインビトロBirA触媒ビオチンタンパク質ライゲーションは魅力的な標識戦略ですが、その用途はAP融合タンパク質を含むサンプルに限定されています。この方法の目的は、天然の未修飾タンパク質を選択的に生体化し、酵素生物化戦略を使用できるアプリケーションの数を拡大するビオチンタンパク質リチウムの新しい変異体の開発です。
タンパク質機能は、所望の機能を有する遺伝子変異、選択、増幅の反復ラウンドを通じて進化させることができる。強く、有効な選択戦略は、指向性進化のために重要であり、ビオチンタンパク質リガーゼ活性は、ビオチンとストレプトアビジンとそのホモログ6との間の強い結合のために容易に選択される。ファージディスプレイ技術は、バイオチニル化ペプチド7、8を表示するファージの選択を可能にします。しかし、単離されたファージの増幅は細菌宿主の感染を必要とするので、ストレプトアビジンを用いたファージ選択は、非変性下でのビオチンとストレプトアビジンの高親和性結合が事実上不可逆的であるという点でボトルネックを生み出す。条件。ビオチン化ファージの可逆結合を確実にするために、親和性の低いモノメリックアビジンが使用され、その結果、適度〜10倍の濃縮7が得られた。我々は最近、アフィニティマトリックスからの溶出の必要性を排除し、それによって以前のBirA選択システム9からボトルネックを取り除く新しいBirA変異体の単離のための細菌表示方法を開発した。実際、当社の細菌表示システムは、1回の選択ステップ9で活性クローンの>1,000,000倍の濃縮を可能にし、新規のBirA変異体の指向進化のための効果的な選択システムを提供します。
当社の細菌表示システムは、C末端6xHisタグを持つBirAと、標的ペプチドの表面表示を可能にする足場タンパク質の2つの成分で構成されています。ペプチドの有効表示はN-ターミニ10、11の両方で観察することができるので、我々は、円形に透過した外膜タンパク質X(eCPX)を増強足場タンパク質を用いた。標的ペプチド配列をeCPXのC-終位に融合させることで、活性BirA変異体を発現する細菌の生体化が保証される。細菌は、ビオチン化ペプチドが表面に表示されるようになったように効果的なストレプトアビジン選択を可能にする(図1a)。
この方法の目的は、天然タンパク質に存在するペプチド配列をビオチン化するBirAの新規変異体を選択することです。このシステムは、プラスミドpBAD-BirA-eCPX-AP上に存在する遺伝子によってコードされ、これは、アビノセ誘導性プロモーターを含むBirA(araBAD)、およびeCPX9を制御するT7プロモーター(図1b)を含む。本プロトコルは、1)標的タンパク質由来のペプチドをeCPXのC末端に組み込む場合の詳細な手順、2)エラーが起こりやすいPCRによるBirAの変異ライブラリーの作成、3)ストレプトアビジン結合細菌の選択について説明する。磁気活性化細胞選別(MACS)、4)細菌濃縮の定量化、および5)単離クローンの初期特性特性。
Protocol
Representative Results
Discussion
すべての選択方法に関しては、洗浄ステップのストリンジェンシーが最も重要です。選択したクローンの増幅前にビーズから細菌を照合する必要がないため、以前にファージディスプレイシステムで行われたように、ビオチンとストレプトアビジンの間の高い親和性結合を使用することができます。BirAバリアント7、8の選択。これにより、希少な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、専門家の技術者の支援のためにモハメド・アブドゥラヒ・アーメドに感謝します。この研究は、ルンドベック財団、ノボ・ノルディスク財団、デンマーク腎臓協会、Aase og Ejnarダニエルセン財団、A.P.モラー医学振興財団、クヌードとエディス・エリクセンからの助成金によって支援されました。記念財団
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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