Intrathekale Lieferung von Antisense Oligonukleotiden im Zentralen Nervensystem der Ratte
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur Abgabe von Medikamenten an das zentrale Nervensystem der Ratte, indem wir einen Katheter in den lendenintrathekalen Raum der Wirbelsäule implantieren. Wir konzentrieren uns auf die Lieferung von Antisense-Oligonukleotiden, obwohl diese Methode auch für die Lieferung anderer therapeutischer Modalitäten geeignet ist.
Abstract
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine wichtige Abwehr gegen den Eintritt potenziell toxischer oder pathogener Wirkstoffe aus dem Blut in das Zentralnervensystem (ZNS). Seine Existenz verringert jedoch auch die Zugänglichkeit systemisch verabreichter therapeutischer Wirkstoffe zum ZNS drastisch. Eine Methode, dies zu überwinden, besteht darin, diese Wirkstoffe direkt in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) zu injizieren und damit die BBB zu umgehen. Dies kann durch Implantation eines Katheters zur kontinuierlichen Infusion mit einer osmotischen Pumpe oder zur Einzelbolusabgabe erfolgen. In diesem Artikel beschreiben wir ein chirurgisches Protokoll zur Abgabe von CNS-targeting Antisense Oligonukleotiden (ASOs) über einen Katheter, der direkt in den Cauda-Equina-Raum der erwachsenen Rattenwirbelsäule implantiert wird. Als repräsentative Ergebnisse zeigen wir die Wirksamkeit einer einzelnen Bolus-ASO-Intrathekalinjektion (IT) über dieses Katheterisierungssystem bei der Abschlagsmenge der Ziel-RNA in verschiedenen Regionen des Ratten-ZNS. Das Verfahren ist sicher, effektiv und erfordert keine teure Ausrüstung oder chirurgische Werkzeuge. Die hier beschriebene Technik kann angepasst werden, um Medikamente auch in anderen Modalitäten zu liefern.
Introduction
Das Gefäßsystem des Zentralnervensystems (ZNS) hat sich zu einem kritischen Regulator der Homöostase entwickelt, der den Handel mit Molekülen steuert, Nährstoffe liefert und Abfall loswird. Dieses System ist auch die erste Verteidigungslinie gegen Angriffe von externen Krankheitserregern, dank einer dichten Verteilung von engen Kreuzungen entlang der Wände der Endothelzellen. Diese engen Kreuzungen bilden einen Aspekt der Blut-Hirn-Schranke (BBB). Während das BBB den Transport von Molekülen ermöglicht, die zur Erfüllung des Nährstoff- und Energiebedarfs (z.B. Ionen, Glukose) erforderlich sind, begrenzt es auch selektiv den Durchgang von Krankheitserregern sowie toxischen Chemikalien1,2,3.
Ironischerweise ist die gleiche Schutzfunktion des BBB, die den Durchgang von Krankheitserregern und toxischen Chemikalien begrenzt, auch das Haupthindernis für unsere Fähigkeit, mit therapeutischen Behandlungen nach systemischer Verabreichung an den Organismus leicht auf das ZNS zuzugreifen2, 4,5. Diese Rolle des BBB hat zur Entwicklung einer Vielzahl neuer Technologien und Ansätze für den Vertrieb von Arzneimitteln geführt6.
Eine Möglichkeit, dieses Hindernis zu überwinden, ist die Injektion der Medikamente direkt in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), die kontinuierlich durchdringt sowohl das Gehirn und Rückenmark7,8,9,10. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode, um Agenten erfolgreich in den lendenintrathekalen Raum zu liefern, indem das innere Ende des Katheters vollständig in den Cauda-Equina-Raum der Rattenwirbelsäule gestellt wird. Eine Beschreibung dieses Verfahrens wurde zuvor von Mazur et al. andernorts veröffentlicht11.
Das Protokoll ist sehr effektiv und erzeugt eine Erfolgsrate von mehr als 90% der Antisense-Oligonukleotid (ASO)-Abgabe an das ZNS, wenn es durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Analyse des Zielgenknockdowns8bewertet wird. Das Verfahren verursacht minimale Beschwerden bei den Tieren, da 100% der Ratten die Operation überleben und minimale Schwellungen um die chirurgische Wunde zeigen und keine Anzeichen von Not zeigen (z. B. Hyperaktivität, Dehydrierung, Kreisen, Gleichgewichtsverlust, verminderte Nahrungsaufnahme und Dehydrierung) während der Post-Op-Beobachtung. Ein weiterer Vorteil der hier beschriebenen Methode ist, dass sie weder teure Ausrüstung noch Spezialwerkzeuge benötigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der vorliegende Artikel zeigt eine leistungsfähige Methode, um therapeutische Wirkstoffe direkt in das CNS der Ratte zu liefern. Theoretisch kann eine ähnliche Technik auch bei Mäusen durchgeführt werden, obwohl aufgrund der kleineren Größe die Methode anspruchsvoller sein kann. Daher führt unsere Gruppe intracerebroventricular (ICV) Injektionen bei Mäusen für die CNS-Medikamentenabgabe durch, die die gleichen Ziele über einen anderen Verabreichungsweg erreichen. Diese Methode wurde in einer anderen Studie besc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ionis Pharmaceuticals für die Lieferung der in dem Artikel beschriebenen ASOs.
Materials
| 3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture | 3M | 1020 | ||
| 70% ethanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | ||
| Alcohol swab sticks | Dynarex | NO 1204 | ||
| BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip | BD | 1ml TB Luer-Lok tip | BD 302830 | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in | BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P) | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in | BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B) | |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E | 120V 1.2A |
| BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G | BD | BD 305128 | ||
| Buprenorphine Sustained Release-lab | ZooPharm | Prescription required | ||
| Ethylene oxide sterilizer | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, gas sterilizer | AN 74i | |
| Guide cannula | BD | 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle | BD 305186 | |
| Hamilton syringe 100ul | Hamilton company | Hamilton syringe 100ul | ||
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | STERILIZER MODELNO FST 250 | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra veterranery product | 17033-211-38 | ||
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | ||
| Povidone scrub | PDI | S48050 | ||
| Saline | Baxter | Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml | FE1306G | |
| Scalpel | Feather | disposable scalpel | No. 10 | |
| Small animal heating pad | K&H Manufacturing | Model # 1060 | ||
| Stylet Wire | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 | |
| Surgery Towel drape | Dynarex | 4410 | ||
| Surgical scissors and forceps | FST and Fisher Scientific | |||
| Sutures | Ethicon | 4-0 or 5-0 | ||
| Tool to make the Guide cannular | Grainger | Rotary tool (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) | 1.5” diameter, Pk5 |
| EZ lock cut off Wheel | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | 1.5”, Pk2 | ||
| Grinding Wheel, Aluminum Oxide | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | |||
| EZ lock Mandrel | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | 1.5” diameter | ||
| Diamond wheel floor Tile | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | |||
| Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure | ||||
| Dosing catheter system | SAI Infusion Systems | RIDC-01 | ||
| Guide cannula | SAI Infusion Systems | RIDC-GCA | ||
| Internal Catheters | SAI Infusion Systems | RIDC-INC | ||
| Stylet Wire | SAI Infusion Systems | RIDC-STY |
References
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