光音響フローサイトメトリーを用いた卵巣癌検出
Summary
カスタムメイドの光音響流れ系と標的葉酸キャップ銅硫化銅ナノ粒子を利用した循環卵巣腫瘍細胞を検出するプロトコルが提示される。
Abstract
多くの研究は、循環腫瘍細胞(CtC)の列挙が卵巣癌の予後ツールとしての約束を示すかもしれないことを示唆している。CTCの検出のための現在の戦略は、フローサイトメトリー、マイクロ流体デバイス、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を含みます。最近の進歩にもかかわらず、早期卵巣癌転移の検出方法は、臨床翻訳に必要な感受性および特異性を依然として欠いている。ここでは、フローチャンバーやシリンジポンプを含むカスタム3次元(3D)プリントシステムを利用した光音響フローサイトメトリー(PAFC)による卵巣循環腫瘍細胞の検出に関する新しい方法を提示する。この方法は、PFCによるSKOV-3卵巣癌細胞を標的とする葉酸キャップ硫化銅ナノ粒子(FA-CuS NPs)を利用する。この研究は、卵巣癌細胞に対するこれらの造影剤の親和性を示す。その結果、蛍光顕微鏡によるNP特性評価、PAFC検出、NP取り込みが示され、生理学的に関連する濃度で卵巣CtCを検出するこの新規システムの可能性を実証した。
Introduction
卵巣癌は最も致命的な婦人科の悪性腫瘍の一つであり、2018年に世界中で推定184,800人の死亡をもたらした。複数の研究は、卵巣癌の進行(すなわち、転移)とCTC2、3、4の存在との間の相関関係を示している。CTCの検出および単離のための最も一般的な方法は、EpCam受容体5を標的とするセルサーチシステムを利用する。しかしながら、EpCam発現は、癌転移6に関与している間葉転移に対する上皮においてダウンレギュレートされる。進歩にもかかわらず、現在の臨床技術は依然として低い精度、高コスト、複雑さに苦しんでいます。これらの欠点により、卵巣CTCの発見と列挙のための新しい技術は、研究の重要な分野となっています。
近年、PAFCは、がん細胞の非侵襲的検出、ナノ材料の分析、および細菌7、8、9の同定に有効な方法として浮上した。PAFCは、光音響を利用して流れの中の分析物を検出することにより、従来の蛍光フローサイトメトリーとは異なります。光音響効果は、熱弾性膨張を引き起こす材料によってレーザー光が吸収されると生成され、超音波トランスデューサ10、11によって検出できる音響波を生成する。従来のフローサイトメトリー法に対するPAFCの利点は、簡潔さ、臨床設定への翻訳の容易さ、および患者サンプル12、13における前例のない深さでのCTCの検出を含む。最近の研究では、内因性および気球コントラスト14、15を用いた細胞の検出にPAFCシステムを利用している。近赤外線(NIR)は、インドシアニン緑色色素などの光吸収造影剤、および金属NP(例えば、金およびCuS)を光音響イメージング16、17、18と組み合わせて細胞および組織の選択的標識に使用されている。生体組織内のNIR光の浸透深さが改善されたため、吸収剤の光音響検出は臨床応用のためのより大きな深さで行うことができる。クリニックでの使用の可能性が大きいため、標的NIR造影剤とPAFCの組み合わせにより、CTCの検出に大きな関心が生じています。
PAFCとターゲット造影剤を組み合わせることで、CTCの精度向上と標的検出を行う患者サンプルの高スループット分析に対する改善されたアプローチが提供されます。CTCの主要な検出戦略の1つは、目的の細胞上に存在する膜タンパク質の特異的ターゲティングです。卵巣CtCの顕著な特徴の1つは、外膜19に位置する葉酸受容体の過剰発現である。葉酸受容体ターゲティングは、葉酸受容体の発現が高い内因性細胞が一般的に発光しており、血流20への暴露が制限されているため、血液中の卵巣CTCの同定のための理想的な戦略である。硫化銅NP(CuS NPs)は、最近、癌細胞21に発現する葉酸受容体を標的とする能力が認められている。NIRの生体適合性、合成の容易さ、吸収と組み合わせることで、これらのNP造影剤はPAFCを利用した卵巣CtCの検出に理想的なターゲティング戦略を作ります。
本研究では、FA-CuS NPの調製と光音響流れ系における卵巣癌細胞の検出のための使用について説明する。CuSのNPは、特に卵巣CTCを標的とし、1,053 nmレーザーで刺激されたときに光音響信号を放出するために葉酸で修飾されます。この結果は、PAFCシステム内でこれらの光音響造影剤をインキュベートした卵巣癌細胞の検出に成功したことを示している。これらの結果は、1細胞/μLの濃度まで卵巣癌細胞の検出を示し、蛍光顕微鏡検査は、SKOV−3卵巣癌細胞22によるこれらの粒子の取り込みに成功したことを確認する。本研究では、FA-CuSのNS合成、蛍光顕微鏡用試料の調製、光音響流れ系の構築、卵巣癌細胞の光音響検出について詳しく説明する。提示された方法は、FA-CuS NPsを利用した流れの卵巣CTCの正常な同定を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、PAFCおよび標的CuS造影剤を利用した卵巣CTCの検出のための簡単な方法である。マイクロ流体デバイス、RT-PCR、および蛍光フローサイトメトリー23、24、25を含む卵巣CTCの検出のための多くの方法が検討されている。これらの範囲の複雑さ、コスト、および精度は、臨床現場での有効性を制限します。PAFCは?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、合成の助けのためにマドレーヌ・ハウエル、フローシステムを設計する彼の助けのためのマシュー・チェスト、およびSolidWorksの支援のためのイーサン・マーシャールを認めたい。
Materials
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
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