Détection du cancer de l'ovaire à l'aide de la cytométrie du flux photoacoustique
Summary
Un protocole est présenté pour détecter les cellules tumorales ovariennes circulantes à l’aide d’un système de flux photoacoustique sur mesure et de nanoparticules de sulfure de cuivre plaquées à l’acide folique ciblée.
Abstract
Beaucoup d’études suggèrent que l’énumération des cellules de tumeur circulantes (CTC) puisse montrer la promesse comme outil pronostique pour le cancer ovarien. Les stratégies actuelles de détection des CCT comprennent la cytométrie du débit, les dispositifs microfluidiques et la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (RT-PCR). Malgré les progrès récents, les méthodes de détection des métastes précoces du cancer de l’ovaire n’ont toujours pas la sensibilité et la spécificité requises pour la traduction clinique. Ici, une nouvelle méthode est présentée pour la détection des cellules tumorales circulantes ovariennes par cytométrie de flux photoacoustique (PAFC) utilisant un système imprimé tridimensionnel (3D) personnalisé, y compris une chambre d’écoulement et une pompe à seringues. Cette méthode utilise des nanoparticules de sulfure de cuivre à teneur en acide folique (FA-CuS NPs) pour cibler les cellules cancéreuses ovariennes SKOV-3 par PAFC. Ce travail démontre l’affinité de ces agents de contraste pour les cellules cancéreuses de l’ovaire. Les résultats montrent la caractérisation de NP, la détection de PAFC, et l’utilisation de NP par microscopie de fluorescence, démontrant de ce fait le potentiel de ce nouveau système pour détecter les CTC ovariens aux concentrations physiologiquement pertinentes.
Introduction
Le cancer de l’ovaire est l’une des tumeurs malignes gynécologiques les plus meurtrières et a entraîné environ 184 800 décès dans le monde en 20181. De multiples études ont montré la corrélation entre la progression du cancer de l’ovaire (c.-à-d. métastes) et la présence des CCT2,3,4. La méthode la plus courante pour la détection et l’isolement des CTC utilise le système Cellsearch, qui cible le récepteur EpCam5. L’expression d’EpCam, cependant, est downregulated dans la transition épithéliale à la transition mésenchymale, qui a été impliquée dans la métastasie de cancer6. Malgré les progrès réalisés, les technologies cliniques actuelles souffrent encore d’une faible précision, d’un coût élevé et d’une complexité. En raison de ces inconvénients, les nouvelles technologies pour la découverte et le recensement des CTC ovariens sont devenues un domaine important pour la recherche.
Récemment, PAFC a émergé comme une méthode efficace pour la détection non invasive des cellules cancéreuses, l’analyse des nanomatériaux, et l’identification des bactéries7,8,9. PAFC diffère de la cytométrie traditionnelle de flux de fluorescence en détectant les analytes en flux en utilisant la photoacoustique. L’effet photoacoustique est généré lorsque la lumière laser est absorbée par un matériau qui provoque une expansion thermoélastique, produisant une onde acoustique qui peut être détectée par un transducteur d’ultrasons10,11. Les avantages de PAFC par rapport aux méthodes traditionnelles de cytométrie de flux incluent la simplicité, la facilité de traduction aux arrangements cliniques, et la détection des CTC à des profondeurs sans précédent dans les échantillons de patients12,13. Des études récentes ont utilisé des systèmes PAFC pour la détection des cellules en utilisant le contraste endogène et exogène14,15. Des agents de contraste absorbant la lumière dans l’infrarouge proche (NIR) tels que le colorant vert endocyanine et les NP métalliques (p. ex., or et CuS) ont été utilisés pour l’étiquetage sélectif des cellules et des tissus en combinaison avec l’imagerie photoacoustique16,17,18. En raison de l’amélioration de la profondeur de pénétration de la lumière NIR dans les tissus biologiques, la détection photoacoustique des absorbeurs peut être effectuée à de plus grandes profondeurs pour des applications cliniques. En raison de son grand potentiel d’utilisation dans la clinique, la combinaison d’agents de contraste NIR ciblés avec PAFC a suscité un intérêt considérable pour la détection des CCT.
PAFC en combinaison avec des agents de contraste ciblés fournit une approche améliorée pour l’analyse à haut débit des échantillons de patients avec une précision accrue et une détection ciblée des CTC. L’une des principales stratégies de détection des CTC est le ciblage spécifique des protéines membranaires présentes sur la cellule d’intérêt. Une caractéristique notable des CTC ovariens est la surexpression des récepteurs foliques situés sur leur membrane externe19. Le ciblage des récepteurs foliques est une stratégie idéale pour l’identification des CCT ovariens dans le sang parce que les cellules endogènes, qui ont une expression plus élevée des récepteurs d’acide folique, sont généralement lumineuses et ont une exposition limitée à la circulation sanguine20. Les nP de sulfure de cuivre (NPs de CuS) ont été récemment reconnus pour leur capacité à cibler des récepteurs foliaires exprimés sur des cellules cancéreuses21. Combinés à leur biocompatibilité, à leur facilité de synthèse et à leur absorption dans le NIR, ces agents de contraste NP constituent une stratégie de ciblage idéale pour la détection des CTC ovariens utilisant paFC.
Ce travail décrit la préparation des NP FA-CuS et leur utilisation pour la détection des cellules cancéreuses ovariennes dans un système de flux photoacoustique. Les IP CuS sont modifiés avec de l’acide folique pour cibler spécifiquement les CTC ovariens et émettent un signal photoacoustique lorsqu’ils sont stimulés avec un laser de 1 053 nm. Les résultats indiquent la détection réussie des cellules cancéreuses ovariennes incubées avec ces agents de contraste photoacoustique s’insinpeuser dans le système PAFC. Ces résultats montrent la détection des cellules cancéreuses ovariennes jusqu’à des concentrations de 1 cellule/L, et la microscopie de fluorescence confirme l’étude réussie de ces particules par les cellules cancéreuses ovariennes SKOV-322. Ce travail fournit une description détaillée de la synthèse FA-CuS NPs, la préparation d’échantillons pour la microscopie de fluorescence, la construction du système de flux photoacoustique, et la détection photoacoustique des cellules cancéreuses ovariennes. La méthode présentée montre l’identification réussie des CTC ovariens dans le flux utilisant des NPs de FA-CuS. Les travaux futurs se concentreront sur l’application clinique de cette technologie vers la détection tôt des métastes de cancer de l’ovaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est une méthode simple pour la détection des CTC ovariens utilisant PAFC et un agent de contraste ciblé de CuS. De nombreuses méthodes ont été explorées pour la détection des CCT ovariens, y compris les dispositifs microfluidiques, RT-PCR, et la cytométrie de flux de fluorescence23,24,25. Ces gammes dans la complexité, le coût, et l’exactitude, limitant leur efficacité dans les arrangements cliniques. PA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Madeleine Howell pour son aide dans la synthèse, Matthew Chest pour son aide à la conception du système d’écoulement et Ethan Marschall pour l’aide de SolidWorks.
Materials
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
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