फोटोध्वनिक फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके ओवेरियन कैंसर डिटेक्शन
Summary
एक प्रोटोकॉल एक कस्टम निर्मित फोटोध्वनिक प्रवाह प्रणाली और लक्षित फोलिक एसिड छाया हुआ तांबा सल्फाइड नैनोकणों का उपयोग परिसंचारी अंडाशय ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रस्तुत किया है ।
Abstract
कई अध्ययनों से पता चलता है कि परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) की गणना अंडाशय के कैंसर के लिए एक शकुन उपकरण के रूप में वादा दिखा सकते हैं । सीटीसी का पता लगाने के लिए वर्तमान रणनीतियों में फ्लो साइटोमेट्री, माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस, और रियल-टाइम पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) शामिल हैं। हाल की प्रगति के बावजूद, प्रारंभिक अंडाशय के कैंसर मेटास्टैसिस का पता लगाने के तरीकों में अभी भी नैदानिक अनुवाद के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और विशिष्टता की कमी है। यहां, एक कस्टम चैंबर और सिरिंज पंप सहित एक कस्टम तीन आयामी (3 डी) मुद्रित प्रणाली का उपयोग करफोटोध्वनिक प्रवाह साइटोमेट्री (PAFC) द्वारा ओवेरियन परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत की जाती है। यह विधि पाएफसी द्वारा स्कोव-3 ओवेरियन कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए फोलिक एसिड-कैप्ड कॉपर सल्फाइड नैनोकणों (एफए-CuS NPs) का उपयोग करती है। यह काम अंडाशय के कैंसर कोशिकाओं के लिए इन विपरीत एजेंटों की आत्मीयता को दर्शाता है। परिणाम ों में फ्लोयोरसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा एनपी लक्षण वर्णन, PAFC डिटेक्शन और एनपी तेज दिखाया गया है, इस प्रकार शारीरिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता पर अंडाशय सीटीसी का पता लगाने के लिए इस उपन्यास प्रणाली की क्षमता का प्रदर्शन किया गया है।
Introduction
ओवेरियन कैंसर सबसे घातक स्त्री रोगों में से एक है और इसके परिणामस्वरूप 20181में दुनिया भर में अनुमानित 184,800 मौतें हुईं। कई अध्ययनों से ओवेरियन कैंसर प्रगति (यानी, मेटाटैसिस) और सीटीसी2,3,4की उपस्थिति के बीच संबंध दिखाया गया है। सीटीसी का पता लगाने और अलगाव के लिए सबसे आम तरीका सेलसर्च सिस्टम का उपयोग करता है, जो ईपीकैम रिसेप्टर5को लक्षित करता है। हालांकि, ईपीसीकैम अभिव्यक्ति को मेसेंचिमल संक्रमण के लिए एपिथेलियल में डाउनरेक्टोरल किया जाता है, जिसे कैंसर मेटास्तासिस6में फंसाया गया है। अग्रिमों के बावजूद, वर्तमान नैदानिक प्रौद्योगिकियां अभी भी कम सटीकता, उच्च लागत और जटिलता से पीड़ित हैं। इन कमियों के कारण, ओवेरियन सीटीसी की खोज और गणना के लिए नई प्रौद्योगिकियां अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बन गई हैं ।
हाल ही में, पीएएफसी कैंसर कोशिकाओं का गैर-आक्रामक पता लगाने, नैनोमैटेरियल्स के विश्लेषण और बैक्टीरिया7,8,9की पहचान के लिए एक प्रभावी विधि के रूप में उभरा। पीएएफसी फोटोध्वनिक का उपयोग करके प्रवाह में एनालाइट्स का पता लगाकर पारंपरिक फ्लोरेसेंस प्रवाह साइटोमेट्री से अलग है। फोटोध्वनिक प्रभाव तब उत्पन्न होता है जब लेजर प्रकाश को एक ऐसी सामग्री द्वारा अवशोषित किया जाता है जो थर्मोलेस्टिक विस्तार का कारण बनता है, एक ध्वनिक तरंग का उत्पादन करता है जिसका पता अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर10,11द्वारा लगाया जा सकता है। पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री विधियों पर पीएएफसी के फायदे सादगी, नैदानिक सेटिंग्स में अनुवाद में आसानी, और रोगी नमूनों में अभूतपूर्व गहराई पर सीटीसी का पता लगाना शामिल है12,13। हाल के अध्ययनों में एंडोजेनस और एक्सोजेनस कंट्रास्ट14,15का उपयोग करकोशिकाओं का पता लगाने के लिए पीएएफसी प्रणालियों का उपयोग किया गया है । निकट अवरक्त (एनआईआर) प्रकाश को अवशोषित करने वाले विपरीत एजेंट जैसे इंडोसियाइन ग्रीन डाइ, और धातु एनपीएस (जैसे, सोना और सीयूएस) का उपयोग फोटोध्वनिक इमेजिंग16,17,18के संयोजन में कोशिकाओं और ऊतकों की चयनात्मक लेबलिंग के लिए किया गया है। जैविक ऊतकों के भीतर एनआईआर प्रकाश की बेहतर पैठ गहराई के कारण, अवशोषकों का फोटोध्वनिक पता लगाना नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अधिक गहराई पर किया जा सकता है। क्लिनिक में उपयोग की अपनी महान क्षमता के कारण, पीएएफसी के साथ लक्षित एनआईआर कंट्रास्ट एजेंटों के संयोजन ने सीटीसी का पता लगाने के लिए काफी रुचि उत्पन्न की है।
लक्षित विपरीत एजेंटों के संयोजन में पीएएफसी बढ़ी हुई सटीकता और सीटीसी का लक्षित पता लगाने के साथ रोगी नमूनों के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए एक बेहतर दृष्टिकोण प्रदान करता है। सीटीसी के लिए प्रमुख पता लगाने की रणनीतियों में से एक ब्याज की कोशिका पर मौजूद झिल्ली प्रोटीन का विशिष्ट लक्ष्यीकरण है। ओवेरियन सीटीसी की एक उल्लेखनीय विशेषता उनके बाहरी झिल्ली19पर स्थित फोलेट रिसेप्टर्स की अतिअभिव्यक्ति है । फोलेट रिसेप्टर लक्ष्यीकरण रक्त में अंडाशय सीटीसी की पहचान के लिए एक आदर्श रणनीति है क्योंकि एंडोजेनस कोशिकाएं, जिनमें फोलिक एसिड रिसेप्टर्स की उच्च अभिव्यक्ति होती है, आम तौर पर चमकदार होती हैं और रक्त प्रवाह20के लिए सीमित एक्सपोजर होती हैं। कॉपर सल्फाइड एनपीएस (CuS NPs) हाल ही में कैंसर कोशिकाओं21पर व्यक्त फोलेट रिसेप्टर्स को लक्षित करने की क्षमता के लिए पहचाना गया है । उनकी जैव अनुकूलता, संश्लेषण में आसानी, और एनआईआर में गहरी अवशोषण के साथ संयुक्त, ये एनपी कंट्रास्ट एजेंट एएफसी का उपयोग करने वाले अंडाशय सीटीसी का पता लगाने के लिए एक आदर्श लक्ष्यीकरण रणनीति बनाते हैं।
यह काम एफए-CuS NPs की तैयारी और एक फोटोध्वनिक प्रवाह प्रणाली में अंडाशय कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उनके उपयोग का वर्णन करता है । CuS NPs को विशेष रूप से ओवेरियन सीटीसी को लक्षित करने के लिए फोलिक एसिड के साथ संशोधित किया जाता है और 1,053 एनएम लेजर के साथ उत्तेजित होने पर फोटोध्वनिक संकेत उत्सर्जित किया जाता है। परिणाम पीएएफसी प्रणाली के भीतर इन फोटोध्वनिक विपरीत एजेंटों के साथ इनक्यूबेटेड अंडाशय कैंसर कोशिकाओं का सफल पता लगाने का संकेत देते हैं । ये परिणाम ओवेरियन कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए नीचे 1 सेल/μL की सांद्रता के लिए दिखाते हैं, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी SKOV-3 अंडाशय कैंसर कोशिकाओं द्वारा इन कणों के सफल तेज की पुष्टि22। यह काम एफए-CuS NPs संश्लेषण, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए नमूनों की तैयारी, फोटोध्वनिक प्रवाह प्रणाली के निर्माण, और अंडाशय के कैंसर कोशिकाओं का फोटोध्वनिक पता लगाने का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। प्रस्तुत विधि एफए-CuS NPs का उपयोग प्रवाह में अंडाशय सीटीसी की सफल पहचान से पता चलता है । भविष्य का काम अंडाशय के कैंसर मेटास्टैसिस का जल्दी पता लगाने की दिशा में इस तकनीक के नैदानिक अनुप्रयोग पर ध्यान केंद्रित करेगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल पीएएफसी और एक लक्षित CuS कंट्रास्ट एजेंट का उपयोग करने वाले अंडाशय सीटीसी का पता लगाने के लिए एक सीधी विधि है। ओवेरियन सीटीसी का पता लगाने के लिए कई तरीकों का पता लगाया गया है, जिनमें माइक्रो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक संश्लेषण के साथ उसकी मदद के लिए Madeleine Howell स्वीकार करना चाहते हैं, उसकी मदद के लिए मैथ्यू छाती प्रवाह प्रणाली डिजाइन, और एसे Marschall SolidWorks के साथ सहायता के लिए ।
Materials
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
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